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神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)属于Betanodavirus病毒属,引起鱼类的病毒性神经坏死(viral nervous necrosis,VNN),主要侵蚀鱼类的中枢神经系统,使受感染部位出现细胞空泡化病变。神经坏死病毒在全球范围内造成了幼鱼和成年鱼类的高致病率和高死亡率,极大地影响了海水以及淡水水产养殖业的发展。NNV为无包膜的单链正义双节段RNA病毒,包含基因组RNA1和RNA2以及转录产生的亚基因组RNA3分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、衣壳蛋白以及B2蛋白。目前市场上针对神经坏死病毒感染多以预防为主,在水平以及垂直层面进行消毒控制病毒传播和感染,而针对神经坏死病毒的疫苗的研究较少,且主要以灭活疫苗以及衣壳蛋白等构建的亚单位疫苗为主,存在着保护力不够、使用需伴有佐剂等弊端。因此本课题拟对神经坏死病毒进行减毒改造,为后续疫苗的研究提供一种新思路。1、首先构建了一套反向遗传操作系统用于神经坏死病毒的体外拯救,以便于后续的遗传操作实验。本实验基于三套不同启动子策略的NNV包装质粒,摸索了四种不同的拯救方案(T7原核启动子转染B7GG细胞并与SSN-1细胞共培养、CMV真核启动子转染293T细胞、T7原核与CMV真核双启动子转染293T与B7GG混合培养细胞、T7原核启动子转染B7GG细胞),最终成功建立了一套适合于神经坏死病毒的拯救系统(T7原核启动子转染B7GG细胞)。2、利用建立的反向遗传操作系统对神经坏死病毒B2蛋白进行突变构建NNV病毒致弱毒株,并体外拯救出神经坏死病毒B2蛋白突变株病毒。对B2蛋白突变株病毒进行了病毒增殖曲线的测定,拯救的未突变病毒以及B2蛋白突变株病毒的增殖速度相比于NNV野生毒株更为缓慢,但病毒增殖能力有所降低;在对细胞毒性蛋白Endo-G和抗病毒通路相关蛋白Mx1的荧光定量检测中,拯救的未突变病毒和B2蛋白突变株病毒引起的两种蛋白表达均远低于野生毒株。同时在B2蛋白突变株病毒感染斑马鱼在体实验中,B2蛋白突变株病毒引起的C反应蛋白以及肿瘤坏死因子的表达水平较野生毒株相比降低,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中,脑部空洞化病变程度减弱。因此,构建的NNV病毒B2蛋白突变株毒力减弱,有助于后续基于B2蛋白突变株病毒的基因工程疫苗开发。3、另外,根据神经坏死病毒对神经系统的高度嗜性,对病毒的RNA1区段进行改造,在3’端添加了具有神经环路标记功能的标签,以此来尝试将神经坏死病毒开发成鱼类的神经环路示踪病毒。在RNA1区段的3’端使用蛋白linker(GGGGS)添加e GFP的C端短肽(E11),利用反向遗传操作系统进行病毒体外拯救后,SSN-1敏感系细胞的感染实验、RT-PCR检测以及带有e GFP的N端(G1-10)转基因斑马鱼在体实验均无法检测到病毒。再次使用更加短小的HA标签和首尾不同位置以及不同连接序列的尝试,最终在使用2倍蛋白linker和F2A将HA标签连接在神经坏死病毒的3’尾端两种改造方式中,通过RT-PCR可以检测到病毒RNA依赖的RNA聚合酶的表达,以及细胞免疫荧光实验可以检测到HA标签的表达,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中同样可以检测到NNV病毒的存在。综上,我们建立了体外拯救神经坏死病毒的方法,并且成功构建出B2蛋白突变株病毒,一定程度上降低了对宿主的毒性作用;另外确定了使用2倍蛋白linker和F2A在病毒基因组上添加HA短肽的方法,为NNV病毒作为神经环路示踪的研究提供了可能。由于病毒基因组的局限性和拯救系统的不完善,在病毒的拯救效率和增殖能力上与野生毒株相比有一定差距,因此还需进一步的摸索和优化。