大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufinann&Gerdemann)引起的大豆(Glycine max)根腐病是大豆生产上极其严重的病害之一；全世界每年因根腐病引起的经济损失可高达10亿美元以上。大豆疫霉为大豆的专性病原茵,田间初侵染源为通过有性生殖过程发育而来的卵孢子；卵孢子在适宜的环境下形成游动孢子囊,并通过孢子囊内原生质体的割裂形成初始接种体游动孢子对寄主进行侵染。对大豆疫霉侵染过程以及与寄主互作的细胞学研究,不仅能够促进对疫霉菌致病机理的了解,还能推动与致病过程相关分子生物学的研究,为认识和掌握该病害发生、流行规律以及制订有效的防治策略提供理论依据。本文采用常规的细胞学染色方法和分子荧光探针对大豆疫霉与感病寄主的侵染互作过程进行了较为系统的细胞学研究；并通过绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)标记菌株的获得,揭示大豆疫霉与寄主亲和、非亲和互作的动态变化过程。大豆疫霉与寄主亲和互作过程的细胞学研究。根据大豆疫霉形态特征的变化,将其侵染过程分为3个主要阶段,即侵染前期、侵入阶段和侵入后扩展阶段。侵染前期,即大豆疫霉的无性生活史阶段,菌丝体通过在体内原生质往顶端地流动聚集,逐渐膨大发育形成无性生殖结构游动孢子囊；并通过对游动孢子囊内的原生质体的割裂形成初始侵染体游动孢子。侵入阶段,游动孢子通过游动寻找的到适合寄主后,随即在寄主表皮细胞间休止、附着,并通过萌发形成的芽管在寄主表面寻找适合侵入位点。约接种后3h,绝大多数萌发的休止孢并没有在芽管顶端形成明显的附着胞结构,而是以芽管为侵入结构在表皮细胞间隙处直接穿透寄主。侵入后扩展阶段,绝大多数休止孢在接种后6h已成功侵入寄主；初始侵入茵丝主要在寄主体内细胞间的空隙进行延伸扩展,同时茵丝两侧开始形成圆盘状的吸器结构。接种后约20h,侵染菌丝已扩展到下胚轴髓部(木质部),充满整个组织细胞,并开始向表皮外扩展生长。苯胺蓝和DAB的显色标记表明,侵入位点周围的寄主细胞产生了显著的胼胝质积累,活性氧(ROS)迸发、以及过氧化物酶的聚集分布。大豆疫霉绿色荧光蛋白标记茵株的遗传稳定转化。利用GFP标记对侵染过程进行示踪,是目前研究植物病原菌与寄主互作的最为有效的细胞学方法之一。本研究对卵茵遗传稳定转化载体pTOR和pHAM34进行改造,成功构建了能够在大豆疫霉中稳定表达含有GFP标记基因的pTOR::GFP和pHAM34::Flag-GFP载体,包括在pHAM34::Flag-GFP载体中引入了多个酶切位点,为今后通过GFP报告系统研究目的基因的功能与定位,以及示踪等提供可能。通过CaC12-PEG介导的稳定遗传转化系统,获得了以pTOR::GFP为导入载体的大豆疫霉GFP荧光菌株。对3个GFP标记菌株的茵落形态与直径、游动孢子囊形成、休止孢萌发、卵孢子形成,以及致病性等生物学性状进行测定,结果表明,GFP的插入表达对大豆疫霉的营养生长、发育过程以及与致病力没有影响。因此,GFP标记菌株完全可以用于研究大豆疫霉与寄主的互作过程。绿色荧光蛋白标记茵株与寄主亲和及非亲和互作过程的细胞学研究。GFP标记显示,大豆疫霉在穿透寄主后,侵染茵丝通过分化形成乳突状的吸器结构与寄主体内细胞保持“亲密接触”；接种后约12小时,侵染茵丝即可到达感病品种Williams下胚轴的木质部(髓部),并逐渐开始在寄主体内形成各种形态的茵丝膨大结构,有瘤状、茵索状、笤帚以及肺叶状等。而在与抗病寄主PRX146-36的非亲和互作中,侵染菌丝不仅主要局限于下胚轴的外皮层,几乎不能扩展至内皮层,并且还引发受侵染部位细胞组织产生与抗病相关的自发荧光现象。尽管在非亲和互作中侵染茵丝也能正常形成吸器、以及各种膨大结构,但这些结构被一层具有自发光性质的物质所覆盖。以上结果阐明了大豆疫霉侵染寄主的动态变化过程,进一步揭示了非亲和互作中寄主的抗病机制；更为重要的是,为今后研究大豆疫霉效应分子分泌、转运,以及如何影响寄主防卫反应的细胞学过程奠定了基础。