大鼠骨髓间充质干细胞培养、纯化及鉴定[目的]探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells MSCs)体外分离、纯化、传代、鉴定、标记的方法,观察MSCs的生物学特性,为进一步使用MSCs移植治疗大鼠血管性痴呆(Vascular dementia,VD)模型奠定基础。[方法]颈椎脱臼处死SD大鼠,收集其股骨的骨髓,采用全骨髓贴壁法培养分离纯化MSCs。通过观察MSCs原代及传代后细胞的形态、生长情况、绘制MSCs的生长曲线,了解MSCs的生长特性、形态特征以及增殖能力。通过流式细胞仪测定MSCs表面标记和体外诱导MSCs向成骨细胞分化对MSCs进行鉴定。[结果]分离培养的MSCs在显微镜下形态呈长梭形,为贴壁生长的成纤维样细胞,第一次传代后的MSCs细胞形态趋于均一,呈漩涡样或者菊花样生长。传代后MSCs在前1-6天生长迅速,7-8天后因为细胞密度的增加而出现接触抑制现象从而生长速度减慢。MSCs的增殖能力随着传代次数的增加逐渐下降。流式细胞仪测定发现大鼠骨髓第三代MSCs几乎均一表达CD 44、CD90,不表达CD34。经体外成骨诱导MSCs能分化为成骨细胞,茜素红S染色可见钙结节阳性,碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase, ALP)示碱性磷酸酶活性升高。[结论]全骨髓培养结合细胞贴壁法体外分离、培养及传代的SD大鼠MSCs纯度高,活力强,性状稳定。血管性痴呆大鼠模型的制备[目的]探讨制备理想的VD动物模型方法,为下一步MSCs移植制作VD动物模型。[方法]首先利用Morris水迷宫对SD大鼠进行筛选,去除不在95%参考值范围之内SD大鼠后将筛选出来的79只大鼠随机分成两组：假手术组10只,模型组69只。模型组采用改良二血管结扎法(2-VO)-间隔3天分别结扎双侧颈总动脉的方法制备VD大鼠VD模型,假手术组进行同样的手术操作,但是不结扎双侧的颈总动脉,笼养4周(w)后用Morris水迷宫试验测定两组大鼠空间学习记忆能力的变化。[结果]84只大鼠,经水迷宫筛选,去除4只,死亡1只。将入选实验的79只大鼠随机分成假手术组10只,模型组69只。造模前假手术组和模型组在逃避潜伏期和平台象限滞留时间均无差异,p值大于0.05。造模后假手术组感染死亡1只,饲养不当死亡2只,余7只。模型组大鼠死亡33只,存活36只,剔除1只肢体活动障碍,3只未达VD标准,本实验共成功制作了32只SD大鼠VD模型。造模后模型组的逃避潜伏期比假手术组明显延长,平台象限滞留时间比假手术组明显缩短,p值小于0.01(表2)。本实验制作模型SD大鼠存活率52.17%,成模率91.43%。【结论】改良后的2-VO的VD模型具有较低的死亡率,成模率较高,易于操作,重复性好等优点,是建立大鼠VD模型较理想的方法。甘露醇对骨髓间充质干细胞移植治疗血管性疾呆大鼠模型的疗效观察【目的】初步探讨甘露醇对骨髓间充质干细胞移植治疗VD大鼠模型疗效的影响。【方法】将造模成功后VD大鼠模型随机分成培养基组8只(注射1ml无血清培养基)、MSCs组11只(注射1×106个MSCs1ml)及甘露醇+MSCs移植治疗组9只(注射1.5g/kg甘露醇后,在10-30分钟之内注射1×106个MSCs1ml),移植后笼养4周,通过Morris水迷宫试验检测以上三组及假手术组大鼠行为学的变化,使用ElISA检测各组大鼠模型大脑额叶皮质和脑脊液内VEGF的含量,HE染色观察额叶皮质病理结构的变化。【结果】MSCs静脉移植4W后,行为学结果为甘露醇+MSCs组和MSCs组逃避潜伏期较培养基组明显缩短,平台象限平均滞留时间延长(p<0.02),甘露醇+MSCs移植组比MSCs组更明显缩短,平台象限平均滞留时间更长(p<0.03)；甘露醇+MSCs组、MSCs组额叶皮质、脑脊液VEGF含量均值比培养基组高(p<0.001)；在额叶皮质中,甘露醇+MSCs组、MSCs组VEGF含量均值比培养基组高,甘露醇+MSCs组VEGF含量均值比MSCs组高,差异具有统计学意义,p都为0.000；在脑脊液中,甘露醇+MSCs组分别与MSCs组、培养基组比较VEGF含量都高(p=0.000),MSCs组比培养基组含量均值高(p=0.021)。甘露醇+MSCs组及MSCs组额叶皮质病理片显示其病理损伤较培养基组轻,神经元细胞数量较多,神经元肿胀、脱失及核固缩现象减少,而以甘露醇+MSCs组改善更明显。【结论】尾静脉注射MSCs能使VD大鼠模型的空间记忆及学习能力改善；甘露醇预处理后进行MSCs尾静脉注射组VD大鼠模型空间记忆及学习能力改善较单独使用MSCs组更加明显。可能机制与甘露醇与MSCs静脉注射联合使用后增加了颅内VEGF的表达及增强了对神经元细胞的保护作用有关。