目的：1.检测2010年9月至2012年12月间中南大学湘雅三医院就诊的9个中国汉族肝豆状核变性(Wilson’s disease, WD)患者及家系的ATP7B基因突变类型及突变频率,并进行单体型分析。2.分析肝豆状核变性患者临床特点,鉴定基因型和表型之间的关系。方法：应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)和基因测序法,检测9个肝豆状核变性患者、部分家系成员及正常对照的ATP7B基因突变情况。结果：1.9个WD家系中发现1个纯合子ATP7B基因突变家系和8个复合杂合子ATP7B基因突变家系。总共有11种突变类型,包括1个无义突变(p.Ser105X)、1个移码突变(c.1708-1G>C)和9个错义突变(p.Arg778Leu、p.Pro840Leu、p.Ala874Pro、p.Thr888Pro p.Thr935Met、p.Pro992Leu、p.Asp1047Val、p.Ile1148Thr和p.Glu1173Lys),但9例WD患者中未发现新突变。同时在ATP7B基因突变检测过程中发现有8种多态,包括p.Ile390Val、p.Ser406A1a、 p.Val456Leu、p.Leu770Leu、p.Arg832Lys、p.Arg952Lys、p.Val1140Ala和IVS18+6T/C。2.共同疾病单体型分析结果发现M1841家系和M4056家系存在共同疾病单体型；M1841家系、M1856家系、M4061家系、M4062家系和M4174家系存在共同疾病单体型；M1807家系和M1856家系存在共同疾病单体型。联合前期试验结果,提示湖南地区WD家系可能存在奠基者效应。3.9个家系ATP7B基因突变检测所发现的11种突变类型中,p.Ala874Pro和p.Thr888Pro两个突变均位于11号外显子中；p.Ile1148Thr和p.Glu1173Lys两个突变均位于16号外显子中。2例患者均存在外显子8的p.Arg778Leu突变,5例患者均存在外显子13的p.Pro992Leu突变,2例患者均存在外显子16的p.Ile1148Thr突变,基因突变频率分别为11.1%,27.8%和16.7%。因此,我们认为外显子8、11、13和16可作为肝豆状核变性的优先筛查区域。4.9例WD患者的临床分析结果显示6例脑型患者发病年龄为20.7±10.9,而3例肝型患者发病年龄为22.7士15.3,肝型患者的发病年龄相比于脑型患者无明显下降(p>0.05)。脑型患者至我院就诊时均合并肝脏症状,均有锥体外系症状,占100%(6/6)。肝硬化、脾大、腹水和黄疸为WD患者常见肝脏症状。所有患者中均发现K-F环和血清铜蓝蛋白(serum ceruloplasmin, CP)降低(<0.2g/L)以及ATP7B基因突变,提示以上3项检查对于WD诊断具有重要意义。结论：1.我们所筛查的9个家系中均发现ATP7B基因突变,共有11种突变类型和8种多态。2.单体型分析发现M1841家系和M4056家系存在共同疾病单体型；M1841家系、M1856家系、M4061家系、M4062家系和M4174家系存在共同疾病单体型；M1807家系和M1856存在共同疾病单体型；提示以上家系可能存在奠基者效应。3.外显子8、11、13和16可作为是湖南地区肝豆状核变性的优先筛查区域。目的：通过将ATP7B siRNA转染到HepG2细胞,达到干扰HepG2细胞中的ATP7B基因表达的目的,构建肝豆状核变性肝细胞模型,并分析ATP7B基因沉默后细胞活性变化和凋亡变化情况,以及凋亡相关基因BCL2和BAX、脂肪代谢通路相关基因SREBP1和细胞增生相关基因MCM7四种基因及蛋白表达情况的变化,探索可能的致病机制。方法：1.采用siRNA干扰的方法,将目标序列为：5’-CCAATTGATATTGAGCGGTTA-3’的ATP7B siRNA以及AllStars Negative Control siRNA分别干扰HepG2细胞后,利用RT-PCR方法检测实验组和对照组中ATP7B基因表达的变化,利用Western blot法检测实验组和对照组中ATP7B蛋白表达的变化,确定最佳ATP7B siRNA干扰浓度和转染时间。2.采用MTT法检测AllStars Negative Control siRNA干扰组和ATP7B siRNA干扰组HepG2细胞在0μM、50μM和200μM三种不同浓度硫酸铜作用后的细胞活性变化。3.采用凋亡染色和电镜观察法检测AllStars Negative Control siRNA干扰组、ATP7B siRNA干扰组、200μM硫酸铜诱导组和ATP7B siRNA干扰+200μM硫酸铜诱导组作用HepG2细胞后4组细胞凋亡变化情况。4.采用RT-PCR和Western blot法分别检测BCL2、BAX、SREBP1和MCM7四种基因表达和蛋白水平的变化情况。结果：1.相比AllStars Negative Control siRNA干扰的HepG2细胞,5nM ATP7B siRNA干扰HepG2细胞24h,48h和72h后,ATP7B基因的表达明显下降达86.3%,93.1%和90.8%(P<0.01),蛋白表达分别下降58.5%,85.5%和82.1%(P<0.01),其中5nM ATP7B siRNA干扰48小时可达最大干扰效率。2.未处理组、AllStars Negative Control siRNA干扰组和ATP7B siRNA干扰组分别经50μM硫酸铜处理和200gM硫酸铜处理后,HepG2细胞活力均随着铜浓度的增高比单独AllStars Negative Control siRNA干扰组分别下降53.3%和79.8%(均P<0.05),相比单独ATP7B siRNA干扰组细胞活力分别下降44.0%和77.6%(均P<0.05)。ATP7B siRNA+200μM硫酸铜组相比较AllStars Negative Control siRNA+200μM硫酸铜组和单独200μM硫酸铜组细胞活力无明显变化(p>0.05)。3.ATP7B siRNA单独处理组约有10.6%细胞发生凋亡,较AllStars Negative Control siRNA干扰组有显著增加(P<0.05)；200μM硫酸铜组细胞凋亡数增加至18.3%,较AllStars Negative Control siRNA干扰组有显著增加(P<0.05)；ATP7B siRNA+200μM硫酸铜组细胞凋亡数增加至24.6%,较ATP7B siRNA单独处理组和200μM硫酸铜单独处理组有明显差异(P<0.05)。4.Real time RT-PCR结果表明ATP7B siRNA干扰组中BCL2mRNA较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h,48h和72h分别降低90.8%,95.4%和96.1%(均P<0.05),而BAX mRNA表达较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h,48h和72h分别增加5.9-fold,6.4-fold和7.2-fold(均P<0.05)；SREBP1mRNA在ATP7B siRNA干扰组中较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h,48h和72h分别降低49.7%,59.9%和80.0%(均P<0.05)；MCM7mRNA在ATP7B siRNA干扰组中较AllStars Negative Control siRNA干扰组在24h,48h和72h分别降低89.2%,95.1%和95.5%(均P<0.05)。5.BCL2蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组,48h组和72h组中较同时间AllStars Negative Control siRNA干扰组分别下调54.6%,19.3%和3.1%(均P<0.05),而BAX蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组,48h组和72h组中较AllStars Negative Control siRNA干扰组分别上调1.8倍,1.7倍和3.2倍(均P<0.05)；SREBP1蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组,48h组和72h组中较同时间AllStars Negative Control siRNA干扰组分别下调42.7%,52.2%和94.9%(均P<0.05)；MCM7蛋白表达在ATP7B siRNA干扰24h组,48h组和72h组中较同时间AllStars Negative Control siRNA干扰组分别下调32.8%,92.4%和93.6%(均P<0.05)。结论：1.目标序列为：5’-CCAATTGATATTGAGCGGTTA-3’的ATP7B siRNA干扰可以有效抑制(?)HepG2细胞内ATP7B mRNA和蛋白的表达,可成功构建肝豆状核变性肝细胞模型。2.铜毒性呈剂量依赖关系,铜可以诱导ATP7B siRNA干扰后的细胞活力下降。3.ATP7B siRNA干扰和高铜对肝细胞有促调亡作用。4.ATP7B siRNA干扰组相比AllStars Negative Control siRNA干扰组HepG2细胞的BCL2、BAX、 SREBP1和MCM7四种基因表达和蛋白水平均有明显变化。