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苜蓿是世界上栽培历史最悠久、分布最广泛的多年生豆科牧草,营养丰富,在畜牧业生产中发挥着重要作用。随着降雨量的减少、人类活动的频繁、土壤沙化的增加、生态环境急剧恶化,草场植被严重退化,苜蓿产量受到很大影响。畜牧业的不断发展,对苜蓿的产量与品质提出了更高的要求。因此,培育高产优质的苜蓿新品种成为亟待解决的问题。通过转基因改良苜蓿性状的方法直接有效,但首先要构建高频稳定的再生转化体系。逆境胁迫能够诱导植物体内抗逆基因表达。干旱、盐渍等逆境生理条件下以及激素ABA积累时,会诱导植物体内脱水素基因(dehydrin gene,DHN)的表达。脱水素属于LEA-II(late embryogenesis abundant proteins-II)家族蛋白,在植物遭受干旱等逆境生理胁迫时发挥非常有效的抗逆保护作用。本实验首先以狗牙根品种‘C299’为材料,采用RACE方法,从干旱处理的‘C299’中获得一个脱水素基因DHNS,然后进行氨基酸序列分析,蛋白结构分析,并在干旱胁迫下分析C299叶片中DHNS的表达量,以及转DHNS基因拟南芥的耐盐性、耐旱性等多种抗性品质。同时,从11个紫花苜蓿品种中筛选出再生性能良好的品种,并研究不同外植体、灭菌时间、激素种类与配比、不同培养基对愈伤组织诱导与分化的影响,探索稳定高效的再生体系,为进一步构建苜蓿转化体系奠定基础。然后,在最优化的再生体系的基础上,探索农杆菌介导的苜蓿转脱水素基因DHNS最优方法。研究不同侵染菌液浓度、清洗液中抗生素浓度、愈伤诱导与分化培养基中不同筛选抗生素种类与浓度下,外植体的农杆菌抑制率,愈伤诱导与分化率和脱水素基因DHNS的转化效率。根据实验结果确定最优方案,构建高效的苜蓿转基因系统。研究结果包括以下几个方面:1、脱水素基因DHNS核酸序列长度为495bp,编码164个氨基酸残基蛋白质。分析该脱水素氨基酸序列,由2个K片段、1个S片段和1个Y片段组成,属于YSK2型脱水素。蛋白结构分析结果显示该DHNS为典型的无序蛋白。在E.coli和拟南芥中超表达该脱水素基因DHNS,分别在干旱、500m M Na Cl、500m M KCl、p H=4和p H=9的环境下生长,转基因E.coli和拟南芥的生长速度均显著高于对照,显著增强宿主菌和拟南芥的抗逆能力,表明该脱水素基因DHNS具有较强的、广谱抗逆功能。2、采用生长5天左右的苜蓿无菌幼苗的下胚轴作为外植体材料诱导愈伤组织。苜蓿种子先用75%的酒精消毒1分钟,然后用0.2%Na Cl O消毒8-12分钟。愈伤诱导阶段一开始先暗培养一周左右,有利于愈伤组织的生长与分化;愈伤诱导培养基采用经过改良的SH1培养基,生长素选用2,4-D,最佳含量为2mg/L;细胞分裂素选用KT,最佳含量为0.4mg/L;愈伤诱导效果最好。最佳诱导分化培养基为改良的SH2培养基,细胞分裂素选用KT,最佳含量为1mg/L;发根培养基采用l/2MS加蔗糖,蔗糖最佳含量为10mg/L。3、苜蓿转基因转化体系建立过程中,用菌液浓度为OD600=0.5的携带目的基因的农杆菌GV3101侵染苜蓿外植体的效果最好,侵染时间30min,共培养时间2-3天,清洗液选用MS加500mg/L Cef。在愈伤诱导时期,培养基为改良SH1加2mg/L 2,4-D、0.4mg/L KT、250mg/L carb与5mg/L Hyg,诱导分化培养基为改良SH2加250mg/L carb与5mg/L Hyg。