猪圆环病毒3型（Porcine Circovrius Type 3,PCV3）是一种新型猪病毒。其发病机制尚不清楚。PCVs无囊膜,具有唯一的结构蛋白—衣壳蛋白（Capsid protein,Cap）。PCV2 Cap与病毒免疫原性和致病性等密切相关,提示PCV3 Cap在病毒入侵和致病性中亦应扮演重要的角色。目前对PCV3 Cap等ORFs编码蛋白的生物学功能尚未被诠释。本文主要研究PCV3 Cap蛋白序列的生物信息学分析,揭示PCV3 Cap等编码蛋白对细胞增殖和凋亡等影响,并探明PCV3 Cap诱导细胞凋亡的相关信号通路。1.PCV3 Cap蛋白序列生物信息学研究本研究收集并检测来自湖南地区猪流产胎儿组织样本（2015-2017年,310份）PCV3基因,将所获阳性序列和Gen Bank中121株PCV3代表序列进行多重比对和遗传进化分析,预测PCV3 Cap抗原表位及其突变等情况。结果表明,湖南省12个地区流产胎儿样品的PCV3阳性率为10%,且呈逐年上升的趋势[2015年7.5%（5/66）,2016年9.2%（10/109）,2017年11.85%(16/135]。序列分析表明,流产胎儿的PCV3 Cap与代表性PCV3毒株的氨基酸同源性为98.60%～100%,且Cap序列出现A184S突变。所获阳性毒株和PCV3代表毒株Cap序列进一步分析发现,Cap序列同源性为90.02%-100%,PCV3 Cap预测的8个B细胞和10个T细胞表位中均存在序列突变,其中B细胞抗原表位E（109～146 aa）和T细胞抗原表位D（72～81 aa）存在的突变位点数最多。研究发现52株属于PCV3a,18株属于PCV3b,50株属于PCV3c。PCV3 Cap在NLS区域内有6处突变（R11K、R12K、H26M、R27K、V31A和R34K）;PCV3b（17/20,85%）和PCV3a（19/26,73%）中Cap氨基酸出现突变的几率较高。而从临床表现有繁殖障碍和流产胎儿的样品中检测出的PCV3序列均存在S77T和I150L突变位点;从伴有发热、肺炎的仔猪以及肺匀浆样本检测出的PCV3序列中均有R10K突变位点,这些特定的突变位点与临床症状的关系需后续深入研究。2.PCV3 Cap蛋白引起细胞生长抑制和细胞死亡为了确定PCV3 Cap等ORFs蛋白对细胞增殖影响,分别构建重组PCV3 Cap等ORFs蛋白的p CI-neo真核表达载体,转染PK-15和Vero表达重组PCV3 ORFs蛋白,研究其表达特性及效率、亚细胞定位,研究PCV3 Cap等ORFs蛋白对细胞的增殖影响,并明确核定位信号对PCV3 Cap表达和细胞增殖的影响。结果表明,间接免疫荧光试验（IFA）检测发现PCV3 Cap等ORFs蛋白在转染24 h后,可在PK-15和Vero细胞中表达,48h时表达量增加。其中,PCV3 Cap表达的阳性细胞率均低于PCV2 Cap,PCV3 Cap蛋白在Vero细胞中的表达水平要高于P K-15细胞。48h时,PCV3 Cap与PCV2 Cap相似,均可引起PK-15细胞形态改变和死亡;同时发现PCV3 Cap可以抑制细胞活力（仅对PK-15）;x CELLigence-RTCA系统实时监测发现PCV3 Cap可抑制PK-15细胞增殖并且具有细胞毒性。进一步研究发现PCV3 NLS缺失在PK-15细胞中表达量高于全长的PCV3 Cap,但与细胞增殖和活力抑制无关。与ORF3多分布于细胞质不同,Rep蛋白在转染后48h时,在细胞质和细胞核均有分布。MTT结果显示,转染PCV3 Rep和ORF3后PK-15细胞活力也相应下降。3.PCV3 Cap诱导PK-15细胞凋亡和细胞周期改变为了确定PCV3 Cap对细胞凋亡的影响,我们通过Hoechst33527染色观察PCV3Cap转染后的细胞核变化,采用Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒检测PCV3 Cap重组蛋白转染后细胞（PK-15和Vero）的凋亡,并对PCV3 Cap引起凋亡的调节机制进行初步研究。结果表明,与对照组相比,PCV3 Cap、PCV3 Rep和PCV3 ORF3转染后48h都出现了核碎裂、核溶解的现象,同时还有凋亡小体出现。采用流式细胞术进行凋亡检测发现PCV3 Cap和PCV2 Cap相似,均可以引起PK-15细胞凋亡。采用了Caspase-9抑制剂（Z-LEHD-FMK）处理PK-15细胞,然后转染PCV3 Cap进行凋亡检测。结果发现,PCV3 Cap引起的细胞凋亡是通过线粒体依赖的caspase-9激活来实现的。同时研究发现,PCV3 Cap诱导PK-15细胞周期阻滞在S期,与PCV2 Cap相似。本研究结果将为诠释PCV3 Cap等编码蛋白的功能、以及深入揭示PCV3 Cap与PCV3致病机制关系奠定理论和实验基础。