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目的:通过观察祛痰活血颗粒含药血清对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠原代肝细胞AQP9的表达及P38MAPK信号通路的影响,进一步从细胞分子层面探讨祛痰活血颗粒调节AQP9表达的作用机制。方法:1、20只雄性SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为空白血清组和含药血清组,空白血清组予以生理盐水(2ml/d)灌胃,含药血清组予以祛痰活血颗粒(2g/d)灌胃,早晚各一次,连续3天,末次灌胃1h后,腹主动脉采血制备血清。2、20只雄性SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为正常组和模型组,正常组饲以普通饲料,模型组饲以高脂饲料,连续饲养10周后,HE染色及油红O染色观察肝组织病理变化。3、造模成功后,采用改良的在体原位两步灌注消化法分离正常大鼠肝细胞和NAFLD大鼠肝细胞,Typan blue染色鉴定细胞活性,倒置相差显微镜和CK-18免疫荧光鉴定细胞的形态和性质。4、将正常大鼠肝细胞作为正常组,NAFLD大鼠肝细胞分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和抑制剂组,培养48h后,正常组及模型组予以10%空白血清,低剂量组予以7.5%空白血清+2.5%含药血清,中剂量组予以5%空白血清+5%含药血清,高剂量组予10%含药血清,抑制剂组予以10%空白血清+1u M P38MAPK抑制剂(SB203580)继续培养24h。Realtime-PCR检测各组肝细胞AQP9 m RNA和P38MAPK m RNA的表达水平。Western-blot检测各组肝细胞AQP9、P38MAPK和P-P38MAPK蛋白的表达水平。结果:1、HE染色:正常组肝细胞排列整齐,细胞内未见脂肪空泡。模型组肝细胞排列不齐,细胞内可见弥漫性的脂肪空泡,呈“气球样”改变。油红O染色:正常组肝细胞仅见少许散在红色脂滴;模型组肝细胞内可见弥漫性大小不等的红色脂滴,细胞脂肪变性明显。2、NAFLD大鼠可获得肝细胞约(1-1.5)×108个/只,细胞存活率>92%,细胞纯度>98%。细胞接种6h后贴壁,24h后呈岛屿状连接,48h后相互连接融合成板片状,细胞呈单核、双核或多核状态。CK-18免疫荧光鉴定阳性。3、与正常组相比,模型组AQP9m RNA及蛋白的表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,中、高剂量组及抑制剂组AQP9 m RNA及蛋白表达降低,其中抑制剂组降低最为显著(P<0.05),而低剂量组与模型组表达无显著差异(P>0.05)。4、与正常组相比,模型组P38MAPK m RNA的表达及蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,低、中、高剂量组及抑制剂组P38MAPK m RNA的表达及蛋白磷酸化水平均有不同程度的降低,其中以中剂量组与抑制剂组降低最为显著(P<0.05),而中剂量组与抑制剂组表达无显著差异(P>0.05)。结论:1、采用改良的在体原位两步灌注消化法能成功获得大量高活性、高纯度的NAFLD原代肝细胞。2、NAFLD大鼠肝细胞中AQP9和P38MAPK的表达均显著高于正常大鼠肝细胞,表明AQP9的和P38MAPK信号通路可能是NAFLD的作用机制之一。3、P38MAPK抑制剂可抑制NAFLD大鼠肝细胞中P38MAPK的表达及其磷酸化,同时NAFLD大鼠肝细胞中AQP9的表达显著降低,提示P38MAPK信号通路对AQP9具有调节作用。4、祛痰活血颗粒含药血清能降低NAFLD大鼠肝细胞AQP9的表达,抑制P38MAPK的表达及其磷酸化,提示P38MAPK信号通路可能是祛痰活血颗粒调节AQP9表达的作用机制之一。