自噬(Autophagy,AP)是真核细胞在正常生长发育过程或遭受饥饿、生物和非生物胁迫时细胞质组分降解和再利用的主要方式之一,主要在维持细胞的静态平衡,发育模式重构、自体免疫、抗逆境胁迫等方面发挥重要作用。早期研究主要集中在酵母和动物细胞,近年来在植物中有所研究,但主要集中在逆境胁迫下植物根尖、叶肉等营养组织,在正常生长发育的植物组织和细胞,特别是生殖细胞中,则鲜有研究。本研究以蜀葵、百合及甘蓝型油菜MS与MF系为材料,结合MDC染色,荧光和透射电镜观察及对自噬相关基因(Atg8)的表达分析,对植物花粉母细胞(PMC)发育过程中自噬作用的存在及其作用机制进行了初步研究。主要结果如下:(1)MDC特异染色显示,在以上植物PMC中皆有大小、数量不等蓝色荧光斑点出现,这些亮斑在蜀葵中主要分布于细胞周边,在百合中则均匀分布在细胞内部,而在油菜中则呈弥散分布。与油菜MF系相比MS系PMC中蓝色亮斑的数量和强度明显地多与强;(2)亚显微结构观察显示油菜MF系与蜀葵PMC细胞中都分布有不同数量的泡状体(液泡前体)。这些泡状体结构多样、大小各异、松散的分布于细胞质中,其内包裹有大量的自噬小体,并且有些自噬体正处于被液泡前体吞噬过程中。但蜀葵PMC中自噬作用明显强于油菜MF系;(3)克隆了油菜及蜀葵Atg8a基因(命名为BnAtg8a、BnAtg8b与ArAtg8a,GenBank注册号分别为KC896379、KC896380与KC896383)。生物信息学分析揭示三者编码的蛋白与其他植物ATG8蛋白同源性都在80%以上,其保守区与已报道的植物ATG8蛋白几乎完全同源。另外还获得了BnAtg8a/b的gDNA全序列,二者均含有5个外显子和4个内含子。(4)RT-PCR分析显示,在油菜MF和MS系中,BnAtg8a在PMC时期、减数分裂期和四分体期花药与幼根中高量表达,而在茎、叶中几乎不表达;在蜀葵中,ArAtg8a在PMCs、茎和叶中均有表达,但表达量各有差别。(5)构建了两个植物过表达载体,利用此载体将35S::eGFP-BnAtg8a和35S::BnAtg8a分别导入油菜MF和MS系,共获得了 25株(其中MF系16株,MS系9株)PCR鉴定阳性转基因系,后续研究正在进行。以上结果表明植物PMC发育过程中的确可能有自噬活动出现,自噬活动的出现在不同的植物中具有一定的普遍性,并且自噬强弱在不同植物中可能具有物种特异性;自噬活动在雄性不育系中可能与PMC败育有关,而在正常可育系中,则可能与维持PMC细胞(花粉)的同质性有关。BnAtg8过表达株系可用于油菜自噬作用和油菜PMC发育过程中自噬分子机制与组织定位等研究,另外,由于自噬对抗逆有一定助益,所以可以用于评估自噬在油菜抗逆中的作用,从而为自噬相关基因改造作物在农业生产与运用上提供指导。