肿瘤细胞和肿瘤标志物的检测在肿瘤的临床筛查和诊断中起着非常重要的作用。电化学技术因具有很多如简便、快捷、价廉、灵敏等的优良特性,被广泛地用于小分子、大分子蛋白甚至细胞的检测。DNA和RNA具有容易标记,化学稳定性好以及获取渠道广泛等优势,它作为电化学传感器构建中的重要材料吸引了越来越多学者的关注。本论文致力于构建基于基因转染、杂交和扩增技术的肿瘤细胞和肿瘤标志物临床检测的电化学新方法。1.电化学开关式细胞传感器电化学开关式传感器是一种简单但却有效的传感模式,已用于生物分子如DNA、凝血酶等的检测中。然而,至今仍没有通过电化学开关进行细胞检测的相关报道。其原因是由于细胞膜的非导电性大大限制了氧化还原标签和目标细胞之间的电活性行为。本章中,我们提出了一种细胞响应性电化学开关。这种电化学开关是基于DNA分子末端修饰的二茂铁分子在细胞转染前后在电极表面的电子转移效率的改变而实现的。首先将末端修饰有电活性标签二茂铁(Fc)的探针DNA链通过Au-S键的作用固定到金电极上,然后采用磷酸钙转染方法将DNA链部分送入细胞内部。DNA进入细胞前后,其末端的Fc分子与电极表面的距离发生改变,从而改变了其与电极之间的电子转移效率并因此引发了电化学信号变化。因此通过对电极电化学信号的测量可以对溶液中的细胞进行检测。研究了这种开关式传感对癌细胞的捕获能力、对细胞个数的检测能力以及电极再生能力等。实验表明修饰有DNA的金电极对细胞的捕获能力是裸金电极的8.9倍之多。传感器的信号和103～106cell mL-1细胞浓度的对数值之间呈良好的线性关系。同时在经裂解液处理之后具有一定的再生能力。2.活细胞中survivin mRNA的开关式电化学传感存活素survivin是细胞中凋亡抑制蛋白家族的新成员,它可以促进细胞的有丝分裂以及抑制细胞的凋亡。细胞中的存活素mRNA已经成为癌症早期精确诊断的一种重要的生物标志物。我们进一步设计了一种开关式的电化学传感器检测活细胞中的survivin mRNA。传感机理是基于电极表面DNA分子末端的二茂铁分子在和细胞中mRNA反应后与电极表面之间的电子转移效率的改变。这种方法被用来研究具有不同mRNA水平的细胞群体。基于不同细胞中mRNA量不同而引起的二茂铁分子的电流变化,其可以大致评估细胞群体的细胞癌变状态。设计的于细胞中进行的原位杂交方法避免了很多由于细胞预处理和提取过程产生的各种问题。3.前列腺肿瘤的电化学逻辑门监测我们提出了一种双生物标志物的“AND”逻辑检测模式。将前列腺特异性抗原(PSA)和survivin mRNA的浓度定义为输入信号,嵌插型DNA杂交指示剂Co(phen)33+的电流增加值为输出信号,在金纳米薄膜覆盖的金电极表面进行前列腺癌的诊断。这种逻辑设备避免了单种生物标志物在临床检测中存在的很多限制。第一抗体首先被固定到AuNP电极上,然后在PSA和survivin mRNA都存在的条件下,由于第二抗体上连接的survivin mRNA反义寡核苷酸(ASODN)与待测溶液中survivin mRNA互补而形成dsDNA结构,故而可以观察到Co(phen)33+的信号明显增加。而当只有一种待测物存在时,信号值没有明显的增加。因此,设计的这种“AND”逻辑检测模式大大降低了临床检测中由于前列腺增生以及前列腺炎症等非癌类前列腺疾病造成的假阳性的可能。并且,方法中使用的纳米结构的金电极和直接的电化学输出信号也使得传感过程简单而有效。4.前列腺特异性抗原及端粒酶活性的双功能电化学检测建立了一种针对PSA抗原和细胞中端粒酶活性的双功能的电化学分析方法。方法使用多元结合的生物素-酶链亲和素系统以及氯化血红素/G-四链体DNA酶。该方法可以根据临床需要选择性地检测两种重要的生物标志物,从给定细胞的端粒酶活性检测中得知细胞的状态,或者以灵敏地检测血清中PSA抗原以筛查前列腺疾病。该方法不需要复杂的化学修饰步骤或者热循环放大,同时具有宽的检测范围和好的重现性。通过简单替换相应的抗体,这种传感器可以应用于其他抗原类生物标志物的检测。