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目的:研究内质网应激反应IRE1α-XBP1s信号通路对卵巢癌细胞的作用,包括IRE1α-XBP1s在体外对卵巢癌细胞的活力、增殖速度等的影响,以及在免疫缺陷鼠皮下卵巢癌细胞成瘤和生长情况的影响。方法:1.使用小干扰RNA配合lipofetamine 2000转入培养状态良好的HOC7细胞中,培养2天后,收集细胞提取RNA和蛋白,进行q RT-PCR和Western blot实验,从m RNA和蛋白水平上验证其沉默效果。将转入小干扰RNA的HOC7细胞以1×10~4个细胞种于6 cm培养皿中,分别各在3、5天进行计数,观察敲低XBP1对HOC7细胞的增殖能力的影响。之后将细胞以3×10~3个/孔种在96孔板中,每种细胞各种8个复孔,培养3天后,加入30 n M TG,继续37℃培养3小时后,加入按比例稀释好的CCK-8,在450 nm处测量吸光度,并计算其对应的细胞活力值。2.使用HBLV-h-XBP1 sh RNA1-Zs Green-PURO慢病毒（sh XBP1）转染OVCAR8和HOC7细胞,转入病毒48小时后使用嘌呤霉素筛选一周,收集细胞提取其RNA和蛋白,进行q RT-PCR和Western blot实验,分别在m RNA和蛋白层面上检验XBP1s的表达。之后将转入慢病毒的细胞分别以1×10~4个细胞种于6cm培养皿中,在37℃5%CO2条件下培养,分别在培养的第3、5天用血细胞计数板对用胰酶消化下来的细胞进行计数,并记录相应的数据,实验重复3次。而稳转细胞系sh NC和sh XBP1则以各3×10~3个/孔种在96孔板中,每种细胞各种8个复孔,培养3天后,加入30 n M TG,继续37℃培养3小时后,加入按比例稀释好的CCK-8,在450 nm处测量吸光度,并计算其对应的细胞活力值。将稳转细胞以5×10~3个/孔的量种于6孔板的六个孔中,并设置3个复孔,培养9天后,吸去培养基,用PBS清洗后,用4%多聚甲醛固定液固定,结晶紫染色,观察结果,拍照记录后并使用IMAGE J软件测量被染色细胞群落数量。最后在6孔板中,每孔加入1 m L温热的0.4%琼脂糖凝胶,摇匀静置,使其表面非常平滑。再加入0.2%琼脂糖凝胶与细胞的混合液,同样是每孔1 m L,适度摇匀后放入培养箱中。之后每隔2-3天补一次完全培养基。培养1周左右时,置显微镜下观察细胞是否有显著的集落形成,并拍照记录。最后使用软件IMAGE J对实验观察到的细胞团的面积进行定量比较。3.使用IRE1α的核酸内切酶抑制剂MKC8866作用于卵巢癌细胞,将抑制剂MKC8866以10μM的浓度处理卵巢癌细胞,24小时后提取细胞的RNA进行q RT-PCR实验,在m RNA层面上检测此核酸内切酶抑制剂对XBP1s表达的影响。之后将MKC8866分别以0、0.5、1、5、10和20μM作用卵巢癌细胞,48小时后收集细胞提取蛋白进行Western blot实验,在蛋白层面上检测此核酸内切酶抑制剂对XBP1s表达的影响。将细胞分别以1×10~4个细胞种于6cm培养皿中,在37℃5%CO2条件下培养,分别在培养的第3、5天用血细胞计数板对用胰酶消化下来的细胞进行计数,并记录相应的数据,实验重复3次。将细胞以3×10~3个/孔种在96孔板中,每种细胞各种8个复孔,将MKC8866分别以0、0.5、1、5和10μM作用于细胞后,培养3天,加入按比例稀释好的CCK-8,继续37℃培养3小时后,在450 nm处测量吸光度,并计算其对应的细胞活力值。之后将细胞以5×10~3个/孔的量种于6孔板的六个孔中,分成对照组（DMSO）和给药组（MKC8866 10μM）,每组各3个孔,培养9天后,吸去培养基,用PBS清洗后,用4%多聚甲醛固定液固定,结晶紫染色,观察结果,拍照记录后并使用IMAGE J软件测量被染色细胞群落数量。最后在6孔板中,每孔加入1 m L温热的0.4%琼脂糖凝胶,摇匀静置,使其表面非常平滑。再加入0.2%琼脂糖凝胶与细胞的混合液,同样是每孔1 m L,分为对照组和给药组,每组3个复孔,适度摇匀后放入培养箱中。之后每隔2-3天补一次完全培养基。培养1周左右时,置显微镜下观察细胞是否有显著的集落形成,并拍照记录。最后使用软件IMAGE J对实验观察到的细胞团的面积进行定量比较。4.在体外培养卵巢癌细胞,将用胰酶消化下来的OVCAR8细胞悬浮在50μL RPMI 1640培养基中,并与50μL Matrigel混合。然后将该混合物接种于雌性裸鼠（BALB/c Nu/Nu,5周龄）腹部后侧皮下,2×10~6个/侧的细胞量。出现可触及肿瘤后,随机分组。分为对照组和给药组,对裸鼠进行灌胃治疗。对照组给予蔗糖与微晶纤维素的混合物。给药组MKC8866给药浓度为150 mg/kg/d（用蔗糖与微晶纤维素的混合溶液配制）,裸鼠灌胃9天后,颈椎脱臼处死,取出皮下的瘤组织,10%福尔马林固定过夜,进行免疫组化染色。针对XBP1s、Ki67和cleaved-caspase-3三种不同的指标进行免疫组化染色（Ki67是与细胞生长相关的指标,cleaved-caspase-3是与细胞凋亡相关的指标）。结果:1.使用si RNA后沉默XBP1后,进行RT-q PCR和Western blot实验后发现,在m RNA和蛋白水平上,si RNA的转入对XBP1s的表达有显著的抑制作用;并且在增殖实验中,XBP1s表达量较低的细胞其生长速度明显慢于XBP1s表达量较高的细胞,差异具有统计学意义;在细胞活力的测定中,同样发现XBP1s表达量较低的细胞的活力显著低于XBP1s表达量较高的细胞,且差异具有统计学意义。2.转入HBLV-h-XBP1 sh RNA1-Zs Green-PURO慢病毒后,进行RT-q PCR和Western blot实验后,结果表明此慢病毒的转入对卵巢癌细胞中XBP1s m RNA和XBP1s蛋白的表达有显著的抑制作用。在之后的细胞功能实验中发现,XBP1稳定敲低的细胞的增殖速度、细胞活力显著低于对照组,且差异具有统计学意义;而从克隆实验中不同组别被染色细胞的数量和悬浮实验中细胞团的面积比较得出,XBP1稳定敲低的细胞的集落形成能力明显弱于对照组,差异具有统计学意义。3.使用10μM MKC8866处理卵巢癌细胞会抑制XBP1s m RNA的表达。将MKC8866以0、0.5、1、5、10和20μM处理细胞后,Western blot结果显示MKC8866能够显著XBP1s蛋白的表达,且MKC8866的浓度与其抑制XBP1s的表达的能力呈现一定的剂量反应关系;而在之后的细胞功能实验中发现,使用MKC8866处理过的卵巢癌细胞,在增殖速度、细胞活力和集落形成能力上都明显弱于对照组。4.在裸鼠皮下成功建立异种移植模型后,使用MKC8866对其进行灌胃治疗后会对裸鼠皮下卵巢癌肿瘤组织生长的体积大小产生抑制,并在免疫组化实验结果中显示,使用MKC8866对小鼠进行灌胃治疗一定周期后可以显著减弱肿瘤组织中XBP1s的表达,此外还能够减少增殖指标Ki67以及增强凋亡指标cleaved-caspase-3的表达。结论:内质网应激反应IRE1α-XBP1s信号通路对卵巢癌细胞生长可能发挥重要作用。