背景和目的：胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。近年来，胃癌的发病和死亡逐年下降，但仍然是第四位最常见的恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌居第二位。在我国，胃癌是最常见的上皮源性恶性肿瘤和最主要的肿瘤致死性相关疾病。尽管，临床治疗取得了巨大进步，但手术切除依然是胃癌患者的首选。同其它实体瘤类似，胃癌以局部浸润、区域淋巴结转移和远处转移等为特征，这也是导致患者预后不佳和治疗失败最主要的原因。自分泌运动因子受体（autocrine motility factor receptor，AMFR）是一种细胞表面因子受体，参与了机体内一系列的生理病理过程，包括细胞运动、信号转导和蛋白质泛素化等。研究发现，AMFR高表达同肿瘤恶性生物学行为及其预后密切相关，包括肺癌、舌癌、食管癌，结直肠癌、肝癌、乳腺癌和皮肤癌等。除了诱导细胞迁移，AMFR还作为一种重要的E3泛素连接酶，参与内质网蛋白质降解（endoplasmicreticulum-associated degradation，ERAD）途径。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是常见的生物学现象，在胚胎发育、炎症、组织修复、纤维化，以及肿瘤转移中均发挥重要作用。EMT赋予上皮细胞间质表型，从而使细胞获得侵袭、扩散和抵抗凋亡的能力。E-cadherin是EMT中最具特征性的上皮标志物，也是最典型的粘附分子之一，与β-catenin结合形成复合体，参与细胞间粘附的调控。而β-catenin是Wnt信号通路的核心因子，其表达受磷酸化和泛素介导的蛋白酶体调节。当Wnt信号通路异常激活，β-catenin转入细胞核，发挥转录因子作用，激活下游靶基因，导致肿瘤发生和转移。另外，近年来，RNA干扰被广泛应用于调控基因表达，研究基因功能和信号转导，具有效果显著、特异性高的特点。本研究中，我们将检测AMFR在胃癌中的表达情况，分析AMFR与临床病理参数及预后的相关性，以及在EMT中的作用。在此基础上，我们设计并构建AMFR的shRNA慢病毒载体，特异性沉默胃癌细胞MKN45中AMFR的表达，检测胃癌细胞恶性生物学行为的改变，以及与之相关的靶因子表达变化，并探讨可能的机制。然后，建立裸鼠移植瘤模型进行验证。我们期望这些结果有助于阐明胃癌发生和转移的机制，并为胃癌的演进和治疗提供新认识和新思路。方法：（1）采用免疫组织化学和Western blot检测胃癌组织中AMFR与E-cadherin、N-cadherin的表达，分析AMFR与临床病理参数的相关性及其在EMT中的作用。结合术后随访资料，采用Kaplan-Meier法和Cox回归模型分析AMFR与预后的关系。（2）以AMFR mRNA为靶序列，设计4条干扰片段（含1条阴性对照序列），合成并连接至穿梭载体pLVT867，而后行阳性克隆PCR和测序鉴定。采用三质粒系统包装携带有AMFR干扰序列的重组慢病毒载体pLVT-dsRNA，以梯度稀释计数法测定病毒滴度。然后，用重组慢病毒感染胃癌细胞MKN45，荧光显微镜下观察感染效率并确定最佳MOI。qPCR和Western blot检测不同干扰序列对AMFR mRNA和蛋白表达水平的沉默效果，确定最佳干扰载体。（3）以重组慢病毒载体pLVT-RNAi-AMFR感染胃癌细胞MKN45下调AMFR表达，并建立稳定细胞株。观察AMFR表达沉默后，MKN45的表型改变；MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期和凋亡改变；划痕试验及Millicell小室检测细胞迁移侵袭能力；粘附试验检测细胞同质性和异质性粘附能力；平板克隆形成试验检测细胞体外克隆能力。建立裸鼠移植瘤模型，检测细胞体内成瘤能力，并行H-E染色观察移植瘤病理改变。Western blot检测增殖、凋亡和侵袭转移相关蛋白的表达情况。结果：（1）AMFR在胃癌组织中的表达明显高于邻近正常胃粘膜组织（P<0.05）。E-cadherin在胃癌组织中表达下降，而N-cadherin则呈现表达升高。相关性分析显示AMFR的表达与E-cadherin呈负相关（rs=-0.311）；而与N-cadherin呈正相关（rs=0.381）。Western blot检测结果与IHC相一致。临床病理资料分析显示，AMFR高表达与胃癌浸润深度和淋巴结转移密切相关。Kaplan-Meier法生存分析显示，AMFR阳性患者术后总生存率显著降低，而总复发率升高（P<0.01）。Cox回归模型分析显示，与TNM分期和远处转移类似，AMFR是评估胃癌患者术后总生存期和无瘤生存期的相对独立危险因素。（2）重组慢病毒载体经酶切和测序鉴定证实插入序列正确。慢病毒滴度为5.0×108TU/ml；胃癌细胞MKN45被感染后，由于表达GFP，可观察到绿色荧光，最佳MOI为40，感染效率可达90%以上。qPCR和Western blot检测显示重组载体均可下调AMFR的表达，其中，以pLVT-dsRNA-1最为显著，抑制率达75%以上，遂确定为最佳干扰载体，命名为pLVT-RNAi-AMFR。（3）建立pLVT-RNAi-AMFR稳定感染胃癌细胞MKN45的细胞株后，AMFR mRNA和蛋白表达均明显下降，E-cadherin表达增加，N-cadherin和Vimentin表达减少，细胞上皮表型亦恢复。沉默AMFR表达后，MKN45生长增殖受到抑制，G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，Cyclin D1表达亦下降（P<0.05）；而细胞凋亡率无明显增加，Bax和Bcl-2的表达亦无明显变化（P>0.05）。AMFR表达沉默后，细胞迁移率下降，侵袭的细胞数亦减少；粘附试验显示细胞异质性粘附减弱，而同质性粘附增强；MMP2和MMP9的表达亦下降（P<0.05）。平板克隆形成试验显示细胞体外克隆数减少。裸鼠移植瘤模型显示，AMFR基因沉默后的胃癌细胞MKN45，其肿瘤生长速率减缓，移植瘤的质量和体积均小于对照组（P<0.05）；H-E染色可见较多结构相对疏松区及部分液化坏死区，细胞体积偏小，细胞核固缩，滋养微血管亦少于对照组。Western blot检测显示，AMFR表达沉默后，β-catenin的总表达量虽有下降，但差异无显著性（P>0.05），而β-catenin在细胞核内表达则显著下降（P<0.05）。结论：（1）AMFR异常表达与胃癌浸润深度和淋巴结转移密切相关，提示预后不良，是评估胃癌患者预后的相对独立危险因素之一。过度表达的AMFR可促进胃癌细胞侵袭转移，其机制可能与AMFR参与EMT调节有关。（2）结合RNAi技术构建慢病毒载体可显著沉默目的基因表达。（3）沉默AMFR表达后，胃癌细胞MKN45上皮表型恢复，同质性粘附增强而异质性粘附减弱，细胞生长增殖受抑制，阻滞于G0/G1期，迁移侵袭和体外克隆、体内成瘤能力亦下降。其机制与细胞上皮表型恢复和Wnt/β-catenin信号通路受抑制致下游靶基因（Cyclin D1、MMPs等）表达下调有关。