研究背景:胰岛素分泌的调节部位主要包括近端步骤调节(第二信使水平)和末端步骤调节(胞吐分泌)。目前对近端步骤调节机制的研究比较明确,但对于胰岛素分泌末端步骤的调节机制研究较少,且机制不够明确。近期发现中心粒周蛋白(PCNT)在胰岛β细胞胞浆中表达丰富,而且抑制PCNT表达会导致胰岛β细胞胞浆中胰岛素含量减低,其机制可能是通过细胞骨架蛋白在末端调节步骤中实现对胰岛素分泌的影响。研究PCNT对胰岛素分泌调节的机制有可能为糖尿病治疗提供新的靶点和方向,但目前这方面的研究还不够充分,PCNT调节胰岛素囊泡分泌的机制还有待进一步研究。因此本研究中,我们构建转基因鼠(APCNTβ小鼠),抑制胰岛β细胞内PCNT的表达,观察其对糖耐量异常和胰岛素分泌的影响,探讨其中机制,并探寻可能对PCNT具有调节作用的药物。目的:本研究拟通过建立APCNTβ模型鼠和胰岛素抵抗模型鼠,1.观察PCNT表达减低对糖耐量异常和胰岛素分泌功能的影响;2.检测PCNT表达减低后胰岛β细胞内胰岛素囊泡分布改变,探寻PCNT表达减低导致胰岛素异常分泌机制;3.观察PCNT在随高脂喂养时间延长对糖耐量和胰岛素分泌功能的影响;4.通过细胞试验探寻GLP-1通过PCNT对胰岛素分泌的调节作用。方法:Tet-on诱导系统构建PCNT在胰岛β细胞内表达特异性减低的小鼠模型(ΔPCNTβ小鼠);高脂饲养构建胰岛素抵抗模型鼠(IR小鼠)。比较对照、ΔPCNTβ小鼠和IR小鼠在基线、高脂饲养4周、12周时糖耐量、胰岛素分泌的变化,及胰岛内PCNT、F-actin等的表达,并利用透射电子显微镜观察β细胞内囊泡分布情况。细胞试验采用小鼠MIN6细胞系,分为对照组(低糖组、高糖组)、艾塞那肽组(100nM)、瑞格列奈组(50nM)、Si-PCNT组和Si-PCNT+艾塞那肽组。共聚焦显微镜观察基线、15min、30min、2h、6h 时 MIN6 细胞内 PCNT、INS 和 F-actin 变化,并检测培养液内INS浓度变化。结果:1)与对照组比较,ΔPCNTβ小鼠胰岛内PCNT表达量减低(P<0.01),FBG未见明显差异,但FINS明显升高(P<0.05),在细胞增殖水平未见差异。2)IGPTT 发现ΔPCNTβ 小鼠 0-15min血糖 AUCGlu0-15 较对照组升高(P<0.01),而 GSIS 0-15min胰岛素AUC INSO-15较对照组降低(P<0.05)。3)ΔPCNTβ小鼠胰岛内F-actin表达水平较对照组减低(P<0.01)。电镜发现ΔPCNTβ小鼠胰岛β细胞内距离细胞膜下0-300nm的胰岛素囊泡密度较对照组明显减少(P<0.01);>300nm胰岛囊泡密度无明显差异。4)IR小鼠胰岛内PCNT表达量随高脂饲养时间延长逐渐下降。高脂饲养4周时,与对照组比较,IR小鼠胰岛内的PCNT表达明显减低(P<0.05),空腹胰岛素和GSIS120min胰岛素明显升高(P<0.05),IPGTT显示0-15min的AUCGlu0-5增高(P<0.05),AUC INS0-15有减低趋势但无统计学差异;与ΔPCNTβ+IR比较,IR小鼠胰岛内的PCNT表达更高(P<0.01),空腹胰岛素、GSIS120min胰岛素、AUCGlu0-15 更低(P<0.05),AUC INSO-15 更高(P<0.01)。高脂饲养 12 周时 IR 小鼠的PCNT进一步降低至△PCNTβ小鼠水平,空腹胰岛素、GSIS120min胰岛素、AUCGlu0-15进一步增高,AUC INs0-15也进一步减低,与ΔPCNTβ小鼠无统计学差异。5)Exn组MIN6细胞内PCNT、INS和F-actin表达水平在刺激后15min、30min和2h均明显低于LG和HG对照组;刺激后6h Exn组MIN6细胞内上述指标升高,且高于HG对照组。瑞格列奈组未见到与Exn组同样的作用。6)siRNA抑制MIN-6细胞内PCNT表达后,细胞内F-actin和INS表达水平均减少(P<0.01)。再给予Exn1OOnM干预15min细胞内PCNT、INS和F-actin未见明显改变。结论:1.PCNT通过F-actin调节胰岛素分泌(GSIS 0-15min),主要影响距离细胞膜下300nm以内的胰岛素囊泡分布。2.PCNT在胰岛β细胞内表达减低与糖耐量异常的发生发展关系密切。3.随高脂喂养时间延长PCNT在胰岛β细胞内表达减低,在高脂饮食导致糖耐量异常发生过程中发挥重要作用。4.在高糖环境下GLP-1可能通过PCNT实现对MIN6细胞的双向调节作用:作用早期(<2h)降低PCNT,促进胰岛素分泌;作用后期(>6h)增加PCNT,逐渐恢复胰岛素囊泡储存、避免胰岛素的过度释放。