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生长偶联型启动子具有在对数期高强度表达,进入稳定期后停止表达的特点。本研究以生长偶联型启动子和降解标签组建动态下调开关,以生长偶联型启动子（GPP）、阻遏蛋白、降解标签（ssrA）为基础构建动态上调开关,在成功构建动态上调开关和动态下调开关的基础上,将两种开关合并,以正交的方式分别对两种目的蛋白同时实现上调和下调。莽草酸是大肠杆菌合成芳香族氨基酸的中间代谢物,也是抗流感药物“达菲”的重要前体。葡萄糖二酸是合成多种高效环保的新兴生物质能源的原料,具有巨大的潜在经济价值。而莽草酸和葡萄糖二酸在生物合成中,面临着合成路径与细胞生长竞争前体物质的问题。因此本研究使用分子开关将细胞生长与产物合成解偶联,实现碳代谢流的自主分配。然后应用到大肠杆菌的内源代谢路径中生产莽草酸,和外源代谢路径中生产葡萄糖二酸。主要结果如下所示:1.首先构建生长偶联型启动子文库,以启动子相对活性的峰值为评测标准,最终选择不同强度的启动子rpsL、rpsT P1、rpsA P1、rrnA P1和rrnC P1用于分子开关的组建。构建由ssrA降解标签组成的文库,以降解速率为降解标签的评测标准,选择不同强度的降解标签LAA、DAS+4、DAS+8、GSD和DAS用于后续的研究。接下来使用5种生长偶联型启动子和5个强度的降解标签控制GFP的表达,获得25种动态下调开关,按照25种分子开关的积分,选择不同强度的rrnC-DAS、rrnA-GSD、rrnA-DAS+8、rpsA-DAS+4、rpsA-LAA五种分子开关用于后续实验。使用上述原件对tet原核表达系统进行改造构建动态上调开关,5种动态上调开关具有11.35倍的动态范围:荧光强度最强的为H016,为对照组的85.07%。最后将动态上调开关与动态下调开关合并,组建双功能开关,以正交的方式分别对两种目的蛋白同时实现上调和下调使GFP荧光强度降低了11.31倍,而mKate2荧光强度提高了6.04倍。2.然后将双功能分子开关应用到大肠杆菌的内源代谢路径中,通过使用双功能分子开关调控碳流量实现莽草酸的合成与大肠杆菌的生长解偶联。使用glf替换ptsHIcrr,并对aroL和aroK进行敲除,构建莽草酸生产菌株。接下来将双功能分子开关应用到莽草酸的生产中,经过72 h发酵后筛选出最优生产菌株H204,莽草酸积累量为1.64 g·L-1。对其他基因型的大肠杆菌如DH5α、JM109、W3110、ATCC 8739和B0013在相同的位点进行改造。含双功能开关菌株的莽草酸产量相比对照组具有13.84到69.53倍的提升。菌株H204置于5 L发酵罐中进行发酵测试,经过72 h发酵,产量升高到14.33 g·L-1。3.最后将双功能分子开关应用到大肠杆菌的外源代谢路径中,通过使用双功能分子开关调控碳流量分布生产葡萄糖二酸。敲除基因uxaC、gudD和pfkA构建底盘微生物,将双功能分子开关应用到葡萄糖二酸的生产中,经过48 h发酵后筛选出最优生产菌株H305,OD600为4.22,葡萄糖二酸的产量为1.16 g·L-1。对其他基因型的大肠杆菌如DH5α、JM109、W3110、ATCC 8739和B0013在相同的位点进行改造。所有含双功能开关的菌株葡萄糖二酸产量具有9.76倍的动态范围。将最优菌株H305置于5 L发酵罐中进行发酵测试,经过48 h发酵,最终积累1.56 g·L-1葡萄糖二酸。