“益生菌是指含有生理性活菌或死菌(包括其菌体和代谢产物),摄取后能够改善黏膜表面的微生物群或酶的平衡,或刺激机体特异性或非特异性免疫应答机制,增强定植能力或免疫能力的微生物”现代益生菌概念及理解:除上述表象外,益生菌的必需性(例如人及动物的免疫系统发育的必需性等);益生菌的免疫调节特性等。水产益生菌领域要比陆生动物益生菌的研究和应用要相对晚一些,近年来水产益生菌的研究及使用才有所发展。益生菌的使用已成为促进水产动物生长和控制疾病的重要手段。具有以下优点:减轻人力消耗降低费用;增加免疫受免动物的比例;可作为口服活载体疫苗载体携带抗原;减轻鱼体应激反应。本研究目的:从天然水域获得的健康虹鳟鱼为实验动物,从其肠道等部位低温分离纯化菌株。经过益生特性筛选得到具有良好益生特性的菌株;再对筛选出的益生菌进行抗感染筛选,获取具有抗病毒能力的嗜冷益生菌株。意义:为虹鳟嗜冷益生菌黏膜活载体疫苗的研究奠定基础。本研究是以辽宁省本溪市自然水域获得散养健康虹鳟鱼为实验动物,立即在实验室无菌条件下进行迫杀、低温分离肠道等部位菌株;对分离菌株进行温度梯度筛选,获得虹鳟嗜冷菌株;通过分子生物学方法对嗜冷菌株进行鉴定,除去致病菌及条件致病菌;对虹鳟嗜冷益生菌株的进行体外益生特性筛选,确定嗜冷益生菌株候选菌株;对虹鳟嗜冷益生菌株进行抗病毒特性初步筛选;再运用TNF-αactivitated HT29-cells and PBMCs System对候选菌株进行第二重抗病毒筛选;经过多重筛选得到的6株虹鳟嗜冷益生菌株与1‰传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的EPC细胞共培养测定培养上清中的病毒滴度,以确定候选菌株体外抗病毒能力;对6株虹鳟嗜冷益生菌株进行生理生化试验,确定最适培养基、最适温度及最适生长pH;对筛选出的候选菌株进行环境压力耐受测试,耐高胆酸游离酸试验、耐低p H试验;探索菌株微胶囊化方式以及优化;制定饲喂程序进行动物试验对候选菌株进行安全性评价;连续饲喂7天后进行8倍的LD50进行攻毒IHNV(Sn1203株),对6株候选菌株的体内抗病毒能力进行验证及饲喂候选菌株免疫效果评价,测定试验过程中血清中总补体(ACH50)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LYS)、IgM及IL-2含量变化;测定血清抗体效价。从虹鳟鱼体内肠道等部位低温分离得到83株虹鳟分离菌;通过温度梯度筛选得到严格嗜冷菌株18株。通过嗜冷菌株体外益生特性筛选,经三重体外抗病毒特性筛选方法,得到了6株具有较高体外抗病毒能力的虹鳟鱼体嗜冷益生菌株;采用微胶囊化的方法包被6株虹鳟鱼体嗜冷益生菌株候选菌株连续饲喂动物试验验证其具有良好的益生特性及安全性;随后背鳍注射攻毒,验证多重体外抗病毒筛选方法有效、候选菌株具有良好的体内抗病毒特性,其中32#(Lactococcus lactis subsp.HL1)菌株、10#(Arthrobacter sp.HL4)菌株及58#(Bacillus sp.HL5)菌株具有良好的益生特性及抗病毒特性,能够刺激机体免疫应答,对IHNV感染有一定保护作用,测定免疫保护力(RPS)最高达到22.5%。其中32#乳酸乳球菌亚种(Lactococcus lactis subsp.HL1)菌株能够在0.5%的高胆酸游离酸及pH4.0培养基中正常生长,在候选菌株安全性以及攻毒保护免疫评价均表现出优良的益生特性及抗病毒特性,血清中总补体(ACH50)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LYS)、Ig M及IL-2含量与对照组差异显著(P<0.05)、且高于其它试验菌株。32#乳酸乳球菌亚种(Lactococcus lactis subsp.HL1)具有抗病毒能力,具有良好的益生及抗IHNV病毒特性。为虹鳟嗜冷益生菌黏膜活载体疫苗的研究奠定了基础。