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第一章研究急性排斥反应的同种异基因大鼠肝移植模型的建立目的:探讨研究急性排斥反应的同种异基因大鼠肝移植模型的建立方法,为肝脏移植临床及基础研究提供理想的动物模型。方法:采用改良Kamada’s二袖套法,并在此基础上支架法重建肝动脉、改进肝上下腔静脉缝合及肝脏灌注方法,建立研究急性排斥反应的同种异基因大鼠肝移植模型。共实施大鼠肝移植120例,其中定型手术80例。结果:80例定型手术中,供肝热缺血时间0～2 min,冷缺血时间80 min,无肝期平均为16～21min,手术成功率为85%(68/80);急性排斥反应出现于术后第3 d,术后第7 d各种指标改变最为典型。结论:同种异基因大鼠采用改良Kamada’s二袖套法并重建肝动脉、改进肝上下腔静脉缝合及肝脏灌注方法可建立稳定的研究急性排斥反应大鼠肝移植模型。第二章缺血再灌注损伤程度与同种异基因大鼠肝移植后急性排斥反应的关系目的:探讨缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤程度与同种异基因大鼠肝移植后急性排斥反应的关系。方法:供体选用SD大鼠,受体选用Lewis大鼠。采用改良Kamada’s二袖套法并重建肝动脉、改进上腔静脉缝合及肝脏灌注方法建立肝移植模型。根据供肝切取前冷、热缺血时间的不同分为正常对照组(Sham group),Ⅰ组同基因肝移植对照组(similargene group,Ⅱ组);同种异基因肝移植组(Ⅲ-Ⅵ组)。分别于移植后或假手术后1,3,5,7d处死大鼠,检测血清ALT、AST、AKP、r-GT,进行I/R损伤程度判定;肝组织HE染色做病理组织学检查及排斥反应分级;TUNEL法原位检测肝细胞凋亡;免疫组织化学检测肝组织中Fas、Perforin和granzyme B蛋白的表达;RT-PCR检测新鲜肝组织中Fas、Perforin和granzyme B mRNA的表达。结果:Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组血清ALT、AST、AKP、r-GT水平在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点,均较Ⅰ组明显升高(P＜0.05);Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组血清ALT、AST、AKP、r-GT水平在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点组间比较均有显著性差异(P＜0.05);病理组织学检查发现各组大鼠均存在I/R损伤,其病变范围和程度与I/R损伤程度是相平行的;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组移植肝组织排斥反应评分逐渐增高与I/R损伤程度是相平行的,并随移植后时间的延长至第7d达高峰;Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ组各时间段未见排斥反应;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点肝组织中的AI值均高于Ⅰ组(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组在供肝再灌注后5d、7d肝组织中的AI值均较Ⅱ组升高(P＜0.05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点Fas、Perforin和granzyme BmRNA及蛋白表达较Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ组明显增高(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组在肝移植后1d、3d、5d、7d各时间点组间两两比较均有显著性差异(P＜0.05)。结论:(1)同种异基因大鼠肝移植后急性排斥反应的发生与I/R损伤程度正相关。但如I/R损伤造成移植肝严重损伤,急性排斥反应的发生明显降低。(2)I/R损伤对同种异基因大鼠肝移植排斥反应的影响机理有细胞凋亡的参与,与Fas/FasL和Perforin/granzyme B激活密切相关。(3)I/R损伤造成移植肝严重损伤,则急性排斥反应的发生明显降低。其机制与抑制细胞凋亡调控基因Fas、Perforin/granzyme BmRNA及蛋白的低表达有关。第三章缺血预处理对同种异基因大鼠肝移植后急性排斥反应的影响研究目的:研究缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)对不同程度I/R损伤后急性排斥反应的影响及机制。方法:供体选用雄性SD大鼠,受体选用Lewis大鼠。采用改良Kamada’s二袖套法并重建肝动脉、改进肝上下腔静脉缝合及肝脏灌注方法建立肝移植模型。根据供肝切取前IP与否将大鼠分为正常对照组(Sham group,Ⅰ组);同基因肝移植对照组(similargene group,Ⅱ组);同种异基因肝移植缺血再灌注组(Ⅲa、Ⅲb组);同种异基因肝移植缺血预处理组(Ⅳa、Ⅳb组)。分别于移植后或假手术后1,3,5,7d处死大鼠,检测血清ALT、AST、AKP、r-GT,进行I/R损伤程度判定;肝组织HE染色做病理组织学检查及排斥反应分级;TUNEL法原位检测肝细胞凋亡;免疫组织化学检测肝组织中Fas、Perforin和granzyme B蛋白的表达;RT-PCR检测新鲜肝组织中Fas、Perforin和granzyme B mRNA的表达。结果:Ⅳa组较Ⅲa组、Ⅳb组较Ⅲb组缺血再灌注损伤程度有所减轻,血清ALT、AST、AKP、r-GT水平在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点组间比较有所减轻(P＜0.05);病理组织学检查发现Ⅳa组各时间点病变范围及I/R损伤程度及急性排斥反应的程度均较Ⅲa组明显降低,Ⅳb组各时间点病变范围及I/R损伤程度及急性排斥反应的程度均较Ⅲb组降低(P＜0.05);Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb组在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点Fas、Perforin和granzyme BmRNA及蛋白表达较Ⅰ、Ⅱ组增高(P＜0.05);Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb组逐渐增高至第7天达到高峰,Ⅱ组移植后FasmRNA及蛋白表达3d达到高峰,随后逐渐降低,Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb组在移植后3d、5d、7d肝组织中Fas、Perforin和granzyme BmRNA及蛋白表达均较Ⅱ组高,有显著性差异(P＜0.05);Ⅳa组在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点较Ⅲa组下降,有显著性差异(P＜0.05);Ⅳb组在供肝再灌注后1d、3d、5d、7d各时间点较Ⅲb组下降,有显著性差异(P＜0.05)。结论:(1)IP能相应减轻相同冷、热缺血时间所致I/R损伤程度,减轻急性排斥反应的程度。(2)IP减轻I/R损伤后急性排斥反应的程度,其机制是抑制细胞凋亡调控基因Fas及Perforin/granzyme BmRNA及蛋白的表达。