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研究背景和目的:原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）是一种高度异质性（Tumor heterogeneity）的肿瘤,这种异质性主要表现为肿瘤细胞在肿瘤发生和进化过程中会形成具有不同分子特征和功能差异的细胞团。目前认为肿瘤及其肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）都是异质性的,且这种异质性是造成肿瘤致死、免疫和靶向治疗失败以及耐药的关键因素,因此准确评估PLC的肿瘤和微环境的异质性特点对于开发有效的治疗方法和延长病人预后具有极其重要的意义。肿瘤异质性在时间异质性和空间异质性两个维度中贯穿肿瘤演进的全部过程。在PLC中,时间异质性即肿瘤细胞不同时间阶段的差异;空间异质性则包括了三个方面的特点,分别是不同病人间的肿瘤异质性、同一病人不同肿瘤病灶之间的异质性和同一病人同一肿瘤病灶内部不同区域的异质性。因此,解析PLC的肿瘤异质性需要从时间和空间这两个维度的不同层面对肿瘤进行全面评估。近年发展成熟的单细胞测序技术（Single cell RNA-seq,sc RNA-seq）已在单细胞水平揭示了PLC包括肿瘤细胞分型、免疫细胞浸润、肿瘤相关基质细胞等多方面的异质性特征。然而,单细胞测序技术中单细胞悬液的制备过程造成了肿瘤细胞空间位置信息丢失,使得无法对PLC肿瘤空间异质性特征进行深入探索和研究。为了弥补单细胞测序这一不足,空间转录组学技术逐渐发展起来。其中,由Frisén等人开发的空间转录组学（Spatial transcriptomics,ST）技术最先成熟,该技术通过对贴于带有空间条形码探针的阵列上的冰冻组织RNA进行原位捕获、反转录和扩增,最终实现二维平面内转录组水平的基因测序。目前,此项技术经10XGenomics公司推广已达到每个捕获位点直径约为55μm的分辨率。本课题旨在运用高分辨率ST技术研究原发性肝癌的空间异质性特点,寻找肿瘤病灶不同空间区域及其肿瘤微环境的细胞和分子特征,为肝癌治疗提供新的治疗策略。研究方法:1、采集7例PLC患者肿瘤组织标本,包括4例肝细胞癌、1例胆管细胞癌、1例混合型肝细胞胆管细胞癌以及1例合并门静脉癌栓的肝细胞癌肿瘤和癌栓样本;随后运用局部取样和整体拼接的方式,获取上述肿瘤组织共21个不同空间区域的样本进行ST测序及分析,以全面研究PLC的整体空间异质性特点;2、分析PLC肿瘤边界区域异质性特点:评估肿瘤边界线两侧正常肝组织和肿瘤组织免疫微环境和实质细胞功能差异;3、分析PLC肿瘤内部异质性特点:对空间中彼此接触的细胞亚群的优势基因表达、细胞功能、预后、拷贝数变异（Copy number variations,CNV）等进行全面评估,并在彼此400μm宽度的接触区域内分析配体-受体间相互作用;4、评估每个病例样本中不同肝癌肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）相关基因的表达,筛选并验证与肿瘤侵袭和迁移发生相关的CSC及周围细胞构成;5、基于H&E染色和ST数据中三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures,TLS）,开发用于鉴定TLS的基因集,并在公共数据库中验证其用于预测肿瘤预后的可行性。研究结果:1、原发性肝癌的组织内部亚群具有区域性分布和交错性分布两种空间分布模式,不同的空间模式与不同的克隆进化过程有关;2、PLC边界区域肿瘤纤维包膜与该区域的免疫微环境的异质性相关:其中,当边界区域存在肿瘤包膜时,包膜外侧的正常肝组织中免疫细胞分布较内侧肿瘤组织中更多;当无肿瘤包膜时,肿瘤边界区域免疫细胞浸润程度整体增强、耗竭性T细胞增多,并且肿瘤边界线两侧的免疫细胞分布更加紊乱;3、肿瘤内部不同亚群具有不同优势基因表达、细胞功能、预后以及克隆来源,且肿瘤内部亚群并不独立,在彼此接触的范围会发生广泛的配体-受体相互作用;4、CD47+和PROM1+的CSC的富集与HCC的肿瘤侵袭和迁移呈正相关;5、我们开发了一个新的用于鉴定三级淋巴结构的基因集TLS-50,并在TCGA数据库中发现TLS-50的高评分与原发性肝癌较好预后相关。结论:在本研究中,我们发现原发性肝癌肿瘤亚群的区域性分布和交错性分布两种空间分布模式。在PLC肿瘤边界区域,肿瘤纤维包膜的存在与免疫细胞浸润和亚群分布模式相关。在PLC肿瘤内部,不同的肿瘤亚群各自具有不同基因特征,但在彼此接触区域存在广泛的细胞间通讯。CD47+和PROM1+的CSC富集与HCC的肿瘤侵袭和迁移呈正相关。我们开发了一种新的TLS鉴定基因集TLS-50,初步研究提示评估肿瘤内TLS-50评分可用于预测HCC患者预后。