PCR技术在地表水病原细菌快速检测中的应用研究

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为了建立用多聚酶链反应(PCR)技术快速检测地表水中病原细菌的方法,本试验旨在研究以Shigella dysenteriae(志贺氏痢疾菌)、Vibrio cholerae(霍乱弧菌)、Salmonella tyhrmurium(沙门氏菌)和Escherichia coli.(大肠埃希杆菌)作为参考菌株设计的通用引物在地表水病原细菌检测中的应用价值。利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物(SP1:5’-AAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGA/C-3’,nt 1246-1280;SP2:5’-GCTTGCCAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTTGAGC-3’,nt 1521-1556)。我们提取了西安市区几个不同水体的水样和某污水处理厂二级出水水样中细菌的总DNA,使用通用引物对其进行扩增,并对PCR产物分别进行序列测定及序列同源性分析,同时检测水样中的细菌总数和粪大肠杆菌指标。 结果显示,通用引物扩增4种参考菌株,在电泳图谱上320 bp处均可得到清晰的电泳条带,其特异性通过序列测定及同源性分析得到进一步验证;通用引物PCR可检出250ng/L的大肠杆菌总DNA,其检测的灵敏度可达27.5 cfu/100mL;用通用引物对西安市区不同地表水样进行PCR扩增,其中一条河流和三个湖泊以及城市污水处理厂的二级出水样品的电泳图谱上,在320 bp处都得到了清晰的电泳条带,以上的所有水体都被确认为受到了生活污水的影响;而另外一条被保护的很好并可用作饮用水供应的水样中未扩增出条带。我们也使用了传统培养的方法对细菌进行计数,并与PCR进行比较。与之相对应的粪大肠菌群检测结果显示,只有污水处理厂二级出水和一条被污染的湖水水样有粪大肠杆菌检出,其它水样未被检出,而使用通用引物PCR方法除了可以检测到粪大肠杆菌外,还可以检测到水样中其它的一些病原细菌。 本研究中建立的用PCR方法检测水体中病原细菌与传统检测方法相比较,已经显示出具有特异、快速等优点,它为水环境中细菌的风险评价提供了一种更为可靠的方法。
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