论文部分内容阅读
目的利用化学合成的siRNA抑制Hela细胞ATM基因的表达,建立ATM基因沉默的细胞模型,即HelaATM-细胞;利用常规染色体畸变分析技术和胞质分裂阻滞微核法,通过与Hela细胞比较,研究HelaATM-细胞的放射敏感性。本课题为研究ATM基因沉默的肿瘤细胞的生物学特性提供了细胞模型,探讨了ATM基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响,为研究如何提高肿瘤放射敏感性提供实验思路和实验依据。方法（1）设计合成人ATM基因的4对siRNA、siRNA阴性、siRNA阳性对照及FAM标记阴性对照siRNA各1对,脂质体法介导转染Hela细胞;倒置荧光显微镜下观察转染结果; RT-PCR方法检测转染siRNA 24h后Hela细胞中ATM基因的表达水平;筛选干扰效果明显的siRNA,转染Hela细胞,分别检测转染后24h、48h、72h和96h的Hela细胞中ATM基因的表达水平,观察干扰效果的持续时间;建立ATM基因沉默的HelaATM-细胞模型。（2）采用常规染色体畸变分析法,在HelaATM-细胞和Hela细胞经60Coγ射线0、1、2、3、4和5Gy照射后,观察比较两种细胞的染色体畸变率的差异;分别建立HelaATM-细胞和Hela细胞染色体畸变的剂量效应曲线。（3）采用胞质分裂阻滞微核法,在HelaATM-细胞和Hela细胞经60Coγ射线0、1、2、3、4和5Gy照射后,观察比较两种细胞的微核率和微核细胞率的差异;分别建立HelaATM-细胞和Hela细胞微核率和微核细胞率的剂量效应曲线。结果（1）荧光显微镜下观察到FAM标记的siRNA阴性对照定位在Hela细胞中,表明siRNA成功转染进Hela细胞。（2）RT-PCR结果显示,转染siRNA 24h后,转染序列为1057-1075nt siRNA的Hela1057细胞中ATM基因的表达受到明显抑制（P <0.05）,建立ATM基因沉默的Hela1057细胞模型。（3）RT-PCR结果显示,与Hela细胞相比,Hela1057细胞的siRNA干扰效果持续至转染后96h（P<0.05）;Hela1057细胞中ATM基因的表达在转染siRNA后24h与48h之间以及72h与96h之间无显著性差异（P>0.05）;24h、48h的ATM基因表达水平明显低于72h、96h的表达水平（P <0.05）。（4）在0、1、2、3、4和5Gy照射剂量内,HelaATM-细胞和Hela细胞以双着丝粒体为主要染色体畸变类型;各照射剂量点,HelaATM-细胞染色体畸变率明显高于Hela细胞（P<0.01）;HelaATM-细胞和Hela细胞染色体畸变率与剂量呈正相关,均可拟合成直线方程Y=a+bD模式,且HelaATM-细胞剂量效应直线回归方程斜率明显大于Hela细胞（P<0.05）。（5）在1、2、3、4和5Gy剂量照射下,HelaATM-细胞微核率及微核细胞率均明显高于Hela细胞（P<0.01）,并且两者微核率及微核细胞率与剂量的关系拟合成剂量效应方程为y=a+bD+cD2模式。结论（1）化学合成的siRNA转染Hela细胞,可以明显抑制ATM基因的表达,并建立了ATM基因沉默的Hela ATM-细胞模型;（2）ATM基因沉默的HelaATM-细胞的染色体畸变率明显高于Hela细胞;（3）ATM基因沉默的HelaATM-细胞的微核率和微核细胞率也明显高于Hela细胞。