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使自己种群数量不断扩大,是所有生物个体在自然界生存的最终目标,因此繁衍后代是每个生物个体一生中最重要的大事。而生命的产生自古以来就是人们最关注的问题,开展对生殖领域的研究,对人类本身有着非凡的意义。在人和哺乳动物生殖过程中,胚胎着床是建立妊娠的第一步,是决定妊娠成功与否的关键。成功的着床取决于两个条件:1、处于容受态的子宫内膜和具有侵入性的胚胎;2、两者间的同步协调反应。要达到这两点,母体与胚胎必须从一开始就建立密切的物质和信息联系。有多种分子和细胞水平的调控因子参与这一过程,如内分泌、旁分泌、邻分泌调节因子等,并通过多种细胞信号传导从时间和空间上对胚胎和子宫进行精细调控。但是子宫内膜处于容受态允许胚胎着床的时间极短,称为“着床窗口期”。胚胎通过脱去透明带、定位、黏附、侵入、着床等几个阶段,在“着床窗口期”内完成妊娠第一步。由于涉及到众多基因的调控以及错综复杂的调节因子网络的参与,胚胎着床和早期发育的详细分子机制一直不甚清楚,是生殖研究的热点。
目的:获取与胚胎着床明显相关的基因,并探讨这些基因在小鼠胚胎着床过程中可能的作用机制,为最终阐明胚胎着床分子机理奠定重要的实验基础。
方法:采用基因表达系列分析技术构建小鼠胚胎着床前期(d3)子宫内膜LongSAGE基因文库,并与本研究之前构建的着床窗口期(d5)子宫内膜LongSAGE基因文库进行了比较分析。通过RT-PCR对该文库的可靠性进行了验证。此外,还采用3’-RACE技术对这一标签文库中某些未知片段作了进一步分析和数据库比对。
结果:从构建好的d3 LongSAGE文库中挑选克隆113个进行测序,测序一共得到标签1697个,特异性标签为1222个,其中单一匹配标签625个(占51%),多重匹配标签305个(占25%),新标签(未知标签)293个(占24%)。
与本研究先前构建的着床窗口期(d5)LongSAGE基因文库(本课题组另一博士生完成)进行比较分析,有17个LongSAGE标签在d3的表达水平显著高于d5(大于25倍),有5个LongSAGE标签在d5的表达水平明显高于d3(大于20倍)。有3个未知标签在d3的表达水平显著升高(比d5至少升高12倍),有2个新标签在d5高表达(与d3相比,升高4~5倍)。本文选取了7个差异表达明显的己知基因进行了RT-PCR验证。对15个差异表达明显的未知标签进行3’-RACE分析,其中1个未知标签在相关数据库中成功找到了其对应的基因(gi:34538597)。
结论:
1、本研究成功构建了小鼠胚胎着床前期(d3)LongSAGE基因文库,并与小鼠胚胎着床期(d5)LongSAGE基因文库进行了比较分析,获得了两者部份差异表达标签。还改进了从LongSAGE标签获取cDNA长片段的
2、通过RT-PCR证实了该LongSAGE基因文库的可靠性。
3、采用改良的3-RACE方法,对该LongSAGE标签文库中的部份未知标签进行了分析,确定了其中一个未知标签(TCATAACGATTAACCTG)属于基因(gi:34538597)。
4、对某些差异表达基因的功能及其在胚胎着床过程中所发挥作用进行了充分的讨论,为胚胎着床机制研究提供了有价值的实验资料。