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随着循环肿瘤DNA、循环microRNA(miRNA)和融合基因等在临床疾病发生和诊疗中作用的逐步揭示,无细胞核酸分析在生物学研究和医学诊疗中变得日趋重要。基于此,本论文拟将整合临床检验诊断学和生物分析化学学科交叉的最新研究成果,以DNA纳米自组装和功能核酸酶为纳米级工具,结合临床检验诊断的需求,构建一系列简单、快速、等温、特异、灵敏、免标记的核酸化学发光传感分析新策略。本研究主要包括以下三个部分:1.基于核酸酶级联指数扩增的化学发光成像用于miRNA传感分析本研究基于功能核酸酶技术和级联指数扩增(exponential amplification reaction,EXPAR)分子机器,构建高灵敏、高特异且可视化的化学发光生物传感器,为循环miRNA提供全新检测新策略。研究中发卡开关能够特异识别靶miRNA并形成杂交双链,从而启动扩增机器I,产生引物链。引物链与模板II探针互补杂交形成双链进级联激活指数扩增机器II,产生大量G四链体辣根过氧化物模拟酶,催化发光底物发光,实现信号的转换输出。发卡结构DNA分子探针的设计提高检测的特异性,级联型的指数扩增提高检测的灵敏度,功能核酸酶免标记技术实现信号转导和可视化的miRNA生物传感分析。本章所构建的化学发光传感方法检测miRNA的线性范围为10 fM到100 pM,最低检测限为2.91 fM,且具有单碱基错配分辨能力。同时,该传感方法具有等温、均相、免标记和可视化的优点,有望为循环mirna分析和临床疾病诊断提供有力的检测工具。2.基于双t型dna纳米开关和核酸酶的化学发光成像用于bcr/abl融合基因传感分析本研究基于dna纳米技术和级联型dna扩增机器构建bcr/abl融合基因化学发光型生物传感器,为融合基因检测提供超灵敏、高特异的化学发光成像传感新策略。利用nupack软件设计功能化分子探针,其能够逻辑性识在bcr/abl融合基因并自组装形成bis-3wj纳米结构(bis-threewayjunctionnanostructure,bis-3wj)。该结构激活级联扩增机器,产生大量g四链体辣根过氧化物模拟酶亚单元。该亚单元能够自组装为完整模拟酶,级联催化化学发光底物实现光信号转换输出和逻辑门操作。本章所构建的化学发光成像检测bcr/abl融合基因的最低检测限23fm,线性范围达7个数量级,且具有逻辑识别能力和单碱基错配分辨能力。该方法在复杂基质中显示好的回收率,具有等温、均相、免标记的优点,为慢性粒细胞白血病诊断提供全新的化学发光成像策略。3.基于发卡开关和原位非线性杂交链反应的电致化学发光用于bcr/abl融合基因传感分析本研究基于发卡探针和原位分支化杂交链反应(hybridizationchainreaction,hcr)构建bcr/abl融合基因的电化学发光型生物传感器,为慢性粒细胞白血病诊断提供操作简便、超灵敏、高特异的传感新策略。首先,将捕获探针固定在金电极。随后,将分支化杂交链反应系统溶液滴加在电极表面,在发卡开关上的触发链DNA触发两种底物链和两种辅助链的级联自组装形成分支状DNA纳米结构。在目标分子存在的情况下,其打开发卡开关并将分支状DNA纳米结构连接在电极表面。这种原位HCR反应形成的DNA纳米结构能够通过其DNA双链凹槽与电致发光指示剂(Ru(phen)32+)间的相互作用将随后加入的指示剂引入到电极表面,从而实现信号的指数形式的输出放大。发卡探针和原位非线性杂交链反应的引入到电致发光传感器设计增强了传感器的特异性和灵敏度。本章所构建的ECL方法检测BCR/ABL融合基因的最低检测限为5.49 fM,线性范围为10 fM至1 nM,且具有与正常BCR基因和正常ABL基因进行逻辑区别的能力。另外,该方法具有无酶,免标记,低成本的优势,有望成为白血病临床诊断中融合基因检测提供新的诊疗策略。