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乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)由于其优良的物化特性和生理活性已成为广大研究者广泛研究的热点。乳酸菌EPS是指乳酸菌在其生长代谢过程中产生的代谢产物,它包括依附在细胞壁上的荚膜多糖和分泌到细胞外的粘液多糖。据报道,EPS不仅具有改善发酵乳制品口感、组织状态和流变性的效果,还能作为稳定剂、乳化剂、增稠剂等食品添加剂的替代品,不仅如此,许多乳酸菌EPS已被证实具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗炎症以及降低胆固醇等生理活性。本论文以从新疆赛里木酸奶中筛选到的一株具有产EPS的瑞士乳杆菌MB2-1为研究对象,对其EPS的分离纯化、结构特征和生理功能等进行了系统的研究。1、采用8%(W/V)乳清粉培养基于50 L发酵罐中发酵培养(温度42℃,接种量4%,发酵时间32 h),发酵液经过离心除菌体收集上清液,然后用终浓度为4%(W/V)的三氯乙酸(TCA)去除上清液中的蛋白质,离心收集上清液并减压浓缩,用3倍体积的无水乙醇沉淀得到粗多糖,得率为789 mg/L。2、获得的粗多糖依次利用DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-100凝胶柱进行分离纯化,可以得到三个纯组分,分别命名为LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3。根据对比DEAE-52柱层析前的粗多糖质量和凝胶柱G-100纯化后的多糖组分的含量,可得到LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的得率分别为10.47、46.96和2.81%,总回收率为60.24%。在高效液相色谱上,LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3均显示单一对称的色谱峰,分子量分别为2.08×105、2.04×105和2.01×105Da。分别采用考马斯亮蓝法、硫酸-苯酚法、间羟基联苯比色法和氯化钡-明胶比浊法,测定粗多糖和三个多糖纯组分中蛋白质、总糖、糖醛酸和硫酸基的含量,结果表明,粗多糖、LHEPS-1、 LHEPS-2和LHEPS-3的蛋白质含量分别为4.08%、未检出、未检出和0.29%；中性糖含量分别为71.68、97.85、94.54和67.62%；糖醛酸含量分别为2.98、0.53、1.96和2.53%；硫酸基含量分别为1.43、0.27、0.42和0.87%。3、通过多种方法进行了LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的结构鉴定。多糖的紫外全波长扫描结果显示LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3在190～500nm的波长范围内无核酸和蛋白质的吸收峰,其中LHEPS-3含有微量的蛋白质。单糖组成的分析结果表明LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3均是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,其各自单糖组成的摩尔比为1：2.75：1.33,9.34：1.43：1和2.96：1：1.17。LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3红外光谱分析的结果表明,三者都具有多糖的特征吸收峰,均含有吡喃糖苷；LHEPS-1舍有β-D-Glc和α-D-Man, LHEPS-2和LHEPS-3的红外光谱图基本相似,但单糖组成的比例不同；此外,LHEPS-3中舍有N-H的弯曲振动峰,说明LHEPS-3中含有少量的蛋白质。甲基化反应和气质联用分析的结果说明,LHEPS-1的主链上存在→4,6-D-Manp-(1→和→3,6-D-Glcp-(1→,且有两个分支结构,存在于甘露糖残基上和葡萄糖残基链上,分支结构的末端为D-Glcp和D-GaLp; LHEPS-2糖链的骨架主要由-→4-D-Manp-(1→和-→6-D-Manp-(1→组成,另外-→+4-D-Galp-(1→和→6-D-Glcp-(1→可能存在于骨架链上或分支结构上；分支结构上的分支点在甘露糖残基链上,且分支结构的末端为D-Glcp;LHEPS-3糖链的骨架存在→4,6-D-Manp-(1→和→3,6-D-Manp-(1→,并且各自含有一个分支结构,分支结构的末端为D-Glcp和D-Galp.将1D NMR和2D NMR的结果与上述分析结果相结合,可推测出LHEPS-1→ LHEPS-2和LHEPS-3的结构如下：扫描电镜结果显示,LHEPS-1的表面光滑,成碎片状的聚集态,LHEPS-2和LHEPS-3为管状的聚集态,彼此堆积呈发射状且内部中空。三种多糖组分的原子力显微镜的结果表明,多糖表面形成道钉状的突起,大小不一,小的高度为2 nm,大的高度可达380nm。4、体外抗氧化能力的实验结果表明,胞外多糖具有较强的超氧阴离子自由基清除活性,中等的羟基自由基清除活性和金属离子螯合能力,较弱的DPPH自由基清除活性。多糖样品体外抗氧化能力的顺序依次为粗多糖>LHEPS-3> LHEPS-2> LHEPS-1,其中超氧阴离子自由基清除能力的顺序为粗多糖>LHEPS-2> LHEPS-3> LHEPS-L5、利用体外肿瘤细胞模型进行研究发现,Lactobacilus helveticus MB2-1 EPS对人肝癌细胞HepG-2、人胃癌细胞BGC-823和人结肠癌细胞Caco-2的生长均有一定的抑制作用,其中对HepG-2细胞的增殖抑制作用最强,BGC-823次之,Caco-2最弱,所以苯课题对HepG-2细胞进行深入研究。后续实验结果表明,EPS作用HepG-2细胞后,细胞内的乳酸脱氢酶活力随着多糖浓度的增大而升高,且可以使HepG-2细胞发生明显的皱缩。此外,研究还发现,EPS使HepG-2细胞内的活性氧水平升高,且将细胞的生长周期停滞在(G2／M期,具有较强的凋亡诱导作用,在600 μg／mL时,凋亡率达到26.19%。最后,利用试剂盒法分析检测,EPS能使凋亡酶Caspase-3/9的活性升高。