论文部分内容阅读
背景和目的目前全球范围内有超过13%的人群患有不同程度的慢性肾脏病,慢性肾脏疾病己严重威胁着人类健康。肾小管间质纤维化在肾脏疾病转归中起主导作用,其严重程度是评价肾功能损害程度和疾病预后判断的重要指标。多项研究表明上皮-间充质转分化(endothelial-mesenchymal transition,EMT)在肾脏损伤修复和器官纤维化过程中发挥重要作用,但肾小管上皮细胞发生EMT的分子机制尚未完全阐明,探索肾小管上皮细胞发生EMT的分子调控机制对防治肾脏纤维化具有重要的意义。我们用基因表达谱芯片筛选TGFβ1诱导HK2细胞发生EMT时表达差异的基因,并通过生物信息学分析芯片数据挑选出可能调控HK2细胞EMT的候选基因ETS2和JUNB。目前关于ETS2与JUNB在慢性肾脏纤维化疾病中是否有作用及作用机制的研究未见报道,本研究旨在探讨ETS2和JUNB在肾小管上皮细胞转分化中发挥的作用,以及ETS2是否通过JUNB调控肾小管上皮细胞转分化及肾纤维化进程,为寻找肾纤维化新的治疗靶点提供理论基础。方法和结果1.采用基因表达谱芯片筛查出TGFβ1刺激HK2细胞后共有587个基因表达发生了差异性改变,其中上调基因248个,下调基因339个。用生物信息学对这些表达差异的基因进行分析,初步筛查出12个基因可能与TGFβ1诱导HK2细胞EMT有密切关系。2.用实时荧光定量PCR方法验证发现:在细胞水平,这12个基因的表达趋势与基因表达谱芯片结果一致;而在小鼠肾纤维化模型,只有6个基因的表达趋势与基因表达谱芯片结果一致。通过生物信息学分析和文献检索方法挑选出ETS2基因进行深入研究。3.ETS2主要分布在肾小管上皮细胞核中表达,ETS2在UUO组的表达明显高于sham组。在TGFβ1刺激HK2细胞中,ETS2的表达呈浓度和时间依赖性增高。4.siRNA敲低ETS2在HK2细胞中的表达,明显抑制TGFβ1诱导HK2细胞 EMT,并下调 TGFβ1 诱导 HK2 细胞的 a-SMA、Vimentin、N-cadherin、Collagen I和FN蛋白表达升高。再者,敲低ETS2能明显抑制HK2细胞CCL2、IL18、TNFα 和 IL6mRNA 的表达。5.生物信息学分析预测ETS2与JUNB存在相互作用,我们采用荧光素酶实验,通过分段截短和位点突变的方式,证实ETS2直接调控JUNB的转录及明确了具体的作用位点。敲减或过表达ETS2明显抑制或促进TGFβ1诱导HK2细胞JUNB表达升高。6.JUNB主要分布在肾小管上皮细胞核中表达,在UUO组的肾小管上皮细胞中表达明显高于sham组。在TGFβ1刺激HK2细胞中,JUNB的表达呈浓度和时间依赖性增高。7.在HK2细胞中敲低JUNB的表达明显抑制TGFβ1诱导HK2细胞EMT,并下调TGFβ1诱导HK2细胞的Vimentin、N-cadherin、Collagen I和FN蛋白表达升高。然而,过表达JUNB能明显促进TGFβ1诱导HK2细胞Vimentin、N-cadherin和FN蛋白表达升高。8.敲减JUNB表达明显抑制ETS2对TGFβ1诱导纤维化相关基因表达的促进作用。结论1.在小鼠肾纤维化模型中,ETS2和JUNB表达明显升高;而在HK2细胞中,TGFβ1以浓度和时间依赖性的方式诱导ETS2和JUNB表达增加。2.ETS2和JUNB均能促进TGFβ1诱导HK2细胞EMT形态学改变和纤维化相关蛋白表达。3.ETS2直接调控JUNB的转录和表达,并可能通过调控JUNB表达促进TGFβ1诱导HK2细胞EMT。4.本研究探讨ETS2和JUNB在肾小管上皮细胞转分化中发挥的作用及机制,为寻找肾纤维化新的治疗靶点提供了理论基础。