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狂犬病是一种古老的能引起人和动物严重的中枢神经系统病变的传染性疾病,症状一旦出现则造成致命的脑脊髓炎,无法治疗,接种疫苗是防治本病的唯—措施。为促进对狂犬病的检测、预防和诊断,以及对狂犬病病毒蛋白的结构、抗原变异、毒力、在病毒侵染、转录和复制中的功能的研究,我们将经蔗糖密度梯度纯化后的狂犬病病毒L16株作为抗原制备了抗狂犬病病毒的单克隆抗体,并对其中部分抗体做了抗原表位的鉴定。本研究分为三个部分：第一部分,狂犬病病毒的培养和纯化。本实验以狂犬病病毒L16毒株接种BSR细胞,感染96小时后,收集细胞上清,去除细胞碎片后通过蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定纯化的病毒蛋白。结果提示培养的细胞上清中的病毒得到了很好的富集和纯化,其病毒蛋白含量达到1.0 mg／mL。这为进一步制备单克隆抗体奠定了基础。第二部分,狂犬病病毒L16单克隆抗体的制备和鉴定。以β-丙内酯灭活纯化的L16病毒为抗原,免疫Balb／c小鼠,经初步免疫和加强免疫后,取骨髓瘤(SP／20)细胞和小鼠脾细胞进行细胞融合,并建立ELISA以及免疫荧光筛选体系,通过筛选得到了很多抗不同蛋白阳性杂交瘤株。本研究对其中4个单抗(mAb／N40、mAb／N42、mAb／N46和mAb／P49)所对应的抗原蛋白进行了进一步研究和探讨。首先将狂犬病病毒核蛋白和磷蛋白真核表达的载体通过牛痘病毒(Vaccinia virus)的辅助在BSR细胞中表达,再利用筛选出的4个单抗mAb／N40、mAb／N42、mAb／N46和mAb／P49进行免疫荧光法检测。结果发现单抗(mAb／N40、mAb／N42、mAb／N46)均识别核(N)蛋白,而另一个单抗(mAb／P49)识别磷(P)蛋白。对这四个抗体进行免疫印迹的实验发现MAb／N42和mAb／P49能识别变性的对应抗原蛋白,提示这两个单抗识别线性抗原表位；而mAb／N40和mAb／N46不能识别变性的N蛋白,提示这两个单抗识别是构象型抗原表位。第三部分,抗N蛋白单克隆抗体的抗原表位定位以及抗体的应用。为了确定上述三个抗N蛋白的单克隆抗体的抗原表位,我们构建了不同的氨基端和羧基端缺失突变型的N蛋白的质粒进行体外转录和翻译,并用上述三个抗N单克隆抗体作免疫沉淀和免疫杂交。这些免疫沉淀的分析发现mAb／N40识别的抗原表位位于126-284氨基酸的位置,而mAb／N42和mAb／N46识别的抗原表位位于284-325氨基酸的位置。这些结果提示虽MAb／N40和mAb／N46都识别构象型表位,但是它们分别识别不同构象区域,这说明mAb／N40和mAb／N46不是同一个抗体。应用这三个单克隆抗体检测了中性福尔马林固定街毒DRV和实验室毒株B2C感染的小鼠脑组织,发现只有mAb／N42有阳性反应,而mAb／N40和mAb／N46呈阴性反应,进一步证实后两者识别的是N蛋白的自然折叠的构象型表位,与免疫印迹的反应一致。这些抗体可以用来建立狂犬病诊断程序和研究狂犬病病毒蛋白结构。