论文部分内容阅读
目的:以外泌体为切入点,从外泌体miRNA角度探索活血益气方对缺血性心脏病治疗性血管生成的作用机制。方法:制备大鼠急性心肌梗死模型,并给予活血益气方连续干预4周,采用免疫组织化学染色法检测内皮特异性CD31和α-SMA的表达,观察梗死边缘区微血管内皮细胞增生的情况;腹主动脉取血,提取血清外泌体,透射电镜观察外泌体形态变化,NanoSight检测外泌体粒径,流式细胞术检测外泌体标志蛋白CD63、CD81的表达;采用Agilent2100检测外泌体RNA特性;基于illumina技术测序平台进行单端测序,构建miRNA测序文库;结合生物信息学分析方法,筛选差异表达外泌体miRNA,对差异miRNA进行聚类分析,使用热图展示差异miRNA在不同样本间的表达模式;利用miRand数据库对差异miRNA进行靶基因预测,对靶基因进行GO和KEGG富集分析,以判定差异miRNA主要影响的生物学功能或者通路;通过实时荧光定量RT-PCR方法对筛选出的miRNA高通量测序结果进行验证以及检测活血益气方对验证后的差异表达miRNA的影响;采用miRand数据库进行靶基因预测后,进行GO和KEGG富集分析,对富集于特异性通路的靶基因进行蛋白互作分析,以判定差异miRNA主要影响的生物学功能及通路。结果:1.以CD31检测梗死边缘区心肌组织微血管密度(MVD),模型组与假手术组比较,梗死边缘区心肌组织MVD数目增多(P<0.01),差异有统计学意义;活血益气方组与模型组比较,梗死边缘区心肌组织MVD增多(P<0.05),差异有统计学意义。2.以α-SMA检测梗死边缘区心肌组织微血管密度(MVD),模型组与假手术组比较,梗死边缘区心肌组织MVD数目增多(P<0.01),差异有统计学意义;活血益气方组与模型组比较,梗死边缘区心肌组织MVD增多(P<0.05),差异有统计学意义。3.在透射电镜下观察,外泌体呈杯状结构或茶托状,直径在100 nm左右;使用NTA检测显示,外泌体粒径峰值为134.2 nm,峰形尖锐,无明显杂峰;流式细胞仪检测显示,假手术组、模型组及活血益气组外泌体标志蛋白CD63、CD81均有表达。4.与假手术组相比,模型组大鼠血清外泌体存在22个显著差异表达的miRNA。其中 novel 1007_mature、novel 10_star、novel 1147_mature>novel 1170_mature、novel208_mature、novel238_mature、novel335_mature、novel407_mature、novel539_mature、novel65_mature、novel898_mature>novel 1221_mature、novel921_mature、novel951_mature、mo-miR-484、rno-miR-615、rno-miR-676 表达下调;novel1073_mature、novel130_mature、novel31 1_mature、novel738_mature、novel867_mature>novel928_mature、novel903_mature、mo-miR-181d-5p表达上调。使用miRanda数据库对差异miRNA进行靶基因预测,共预测到7002个靶基因。利用DAVID数据库对miRNA靶基因进行了 GO功能分析和KEGG通路分析。GO功能富集共有3681条,包括742条分子功能和2577条生物过程、362条细胞成分;KEGG富集结果显示共有1 13条通路。5.对22条差异miRNA进行筛选,筛选条件(P<0.01;FC(abs)>2;优先选择已知miRNA进行验证),共有1 1条差异miRNA进行实时荧光定量PCR验证。经实时荧光定量PCR验证,共有6个miRNA PCR验证结果为阳性;与假手术组相比,模型组 novel539_mature、nove1921_mature、novel951_mature、rno-miR-484 表达降低,novel1073_mature、mo-miR-181d-5p表达升高。假手术组与模型组差异基因的表达水平趋势与高通量测序所得数据趋势一致。6.与模型组相比,活血益气方组 novel539_mature、novel921_mature、novel95 1_mature、mo-miR-484 表达升高,novel1073_mature、rno-miR-181d-5p 表达下降。使用 miRanda数据库对差异miR-484进行靶基因预测,共预测到357个靶基因。利用DAVID数据库对miR-484靶基因进行了GO功能分析和KEGG通路分析。GO功能富集共有60条,包括19条分子功能和27条生物过程、14条细胞成分;KEGG富集结果显示共有4条通路,其中钙信号通路与血管新生密切相关;使用String数据库对富集于钙信号通路靶基因做蛋白互作分析中,RYR2及CACNA1D与其他蛋白互作关系最为密切。结论:活血益气方能够促进心肌梗死后血管新生,推测其可能通过调控外泌体miR-484靶向RYR2,参与VEGF诱导的内皮细胞的钙信号传导,从而促进心肌梗死后血管新生。