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实验目的：
外伤性视神经病变(TON)是眼科的常见疾病，也是目前不可逆性视力丧失的主要原因，其临床表现主要为视力下降、色觉障碍、相对性传入性瞳孔阻滞（RAPD）、眼底改变等。目前临床上对于外伤性视神经病变主要采用保守治疗、大剂量激素冲击治疗，若有手术指征则手术治疗。但目前尚无有力的循证医学证据证明任何单一或联合治疗方法对TON有确切疗效。因此，如何保护损伤的视神经，促进损伤后视神经的再生与修复是眼科研究的热点。
改善损伤视神经的局部微环境、恢复轴浆运输促进神经营养、抑制炎症反应以及减少胶质瘢痕形成等措施对于视神经损伤后保护、再生与修复至关重要。曲安奈德（TA）、奈帕芬胺（Nepafenac）均具有抗炎作用。已有研究表明，他克莫司(FK506)作为免疫抑制剂同时还具有促进神经再生及神经功能恢复的作用，其作为免疫抑制剂在临床上广泛应用，但作为神经保护制剂报道较少。临床采用全身给药副作用大，利用缓释载体局部给药可以大大提高药物生物利用度并减少药物全身毒副作用。本实验中我们先制备曲安奈德缓释药膜及他克莫司奈帕芬胺联合缓释药膜，再建立大鼠视神经夹伤模型，将这三种具有抗炎作用的药物直接应用于损伤的视神经周围，以验证其是否对视网膜神经节细胞有保护作用并促进轴突再生以及在视神经损伤局部缓释给药这一给药方式是否可行，为临床上外伤性视神经病变的治疗提供新思路。
实验方法：
通过喷涂法制备聚己内酯（PCL）-曲安奈德及他克莫司+奈帕芬胺缓释药膜，计算药膜中TA、FK506、Nepafenac的载药量，考察药膜体外药物释放行为。
选取73只SD大鼠，随机分为四组：正常组4只、对照组23只、实验组46只（PCL-TA给药组、PCL-FK506+Nepafenac给药组各23只）。大鼠左眼建立视神经夹伤模型，右眼不予处理。建模成功后，在视神经夹伤处沿轴向划开视神经鞘膜进行视神经减压。将药膜裁剪为3*1mm大小，放置于视神经夹伤处。通过以下指标对实验结果进行观察：（1）HE染色：观察大鼠视网膜及视神经的变化；（2）免疫组化：观察大鼠视网膜上caspase-3表达及视神经上GAP-43表达；（3）视网膜铺片及RGCs计数：做免疫荧光标记RGCs并计数；（4）FVEP：记录大鼠术前、术后3、7、14天的FVEP，分析N1、P1潜伏期变化。统计结果以均数±标准差表示，同时间点三组数据进行独立样本t检验，P＜0.05表明有统计学差异。
实验结果：
PCL-TA及PCL-FK506+Nepafenac缓释药膜的载药量分别为:57.4%、23.7%FK506+16%Nepafenac；TA、FK506、Nepafenac三种药物的体外药物释放分别为:在90天、90天及14天内三种药物在体外持续缓慢释放。
视网膜及视神经HE染色结果显示，正常视网膜中RGCs单层排列，密集、整齐,神经纤维平行束状排列，规则密集。随着损伤时间延长，对照组、TA给药组、FK506+Nepafenac给药组视网膜各层均变薄，RGCs逐渐减少，空泡样变性增多，但各时间点对照组比给药组RGCs更为稀疏。随着损伤时间延长，三组神经纤维逐渐稀疏，神经胶质细胞增生，各时间点对照组比给药组神经纤维排列更为紊乱、稀疏。
免疫组化结果显示，caspase-3在正常视网膜中几乎不表达，GAP-43在正常视神经中不表达。随着损伤时间延长，对照组、TA给药组、FK506+Nepafenac给药组视网膜caspase-3阳性细胞数量逐渐增多，各时间点两实验组视网膜中caspase-3阳性细胞数少于对照组。随着损伤时间延长，三组视神经中GAP-43阳性细胞数量逐渐减少，各时间点实验组GAP-43阳性细胞数多于对照组。
正常视网膜RGCs数量为（383.8±21.31）。对照组、TA给药组、FK506+Nepafenac给药组在损伤后3天RGCs数量分别为：（372.8±29.76）、（377.9±48.15）、（367.8±47.7）；损伤后7天RGCs数量分别为：（189.7±27.24）、（151.4±28.41）、（217.6±24.2）；损伤后14天RGCs数量分别为：（42.25±11.68）、（48.5±9.068）、（49.13±7.187）。实验组与空白对照组对比，损伤后3天两组P值分别为0.4777、0.8045(P＞0.05)，无统计学差异。损伤后7d两组P值分别为P＜0.0001、0.0015（P＜0.05），有统计学差异。损伤后14d两组P值分别为0.0323、0.0140，均小于0.05，有统计学差异。
正常大鼠FVEP中N1的潜伏期为（35.32±2.289）ms，P1的潜伏期为（55.7±4.173）ms。损伤后3天、7天、14天，给予PCL-FK506+Nepafenac组N1及P1潜伏期与对照组有统计学差异(P＜0.01)，相比对照组明显缩短。而给予TA缓释药膜治疗组N1及P1的潜伏期与对照组均无统计学差异。
实验结论：
1、在视神经损伤处局部给予PCL-TA缓释药膜对视神经有保护作用，可减少视网膜神经节细胞凋亡，但对缩短损伤后FVEP的N1、P1波潜伏期并无明显改善作用。
2、在视神经损伤处局部给予PCL-FK506+Nepafenac缓释药膜对视神经有保护作用，可减少视网膜神经节细胞凋亡，缩短损伤后FVEP的N1、P1波潜伏期。
外伤性视神经病变(TON)是眼科的常见疾病，也是目前不可逆性视力丧失的主要原因，其临床表现主要为视力下降、色觉障碍、相对性传入性瞳孔阻滞（RAPD）、眼底改变等。目前临床上对于外伤性视神经病变主要采用保守治疗、大剂量激素冲击治疗，若有手术指征则手术治疗。但目前尚无有力的循证医学证据证明任何单一或联合治疗方法对TON有确切疗效。因此，如何保护损伤的视神经，促进损伤后视神经的再生与修复是眼科研究的热点。
改善损伤视神经的局部微环境、恢复轴浆运输促进神经营养、抑制炎症反应以及减少胶质瘢痕形成等措施对于视神经损伤后保护、再生与修复至关重要。曲安奈德（TA）、奈帕芬胺（Nepafenac）均具有抗炎作用。已有研究表明，他克莫司(FK506)作为免疫抑制剂同时还具有促进神经再生及神经功能恢复的作用，其作为免疫抑制剂在临床上广泛应用，但作为神经保护制剂报道较少。临床采用全身给药副作用大，利用缓释载体局部给药可以大大提高药物生物利用度并减少药物全身毒副作用。本实验中我们先制备曲安奈德缓释药膜及他克莫司奈帕芬胺联合缓释药膜，再建立大鼠视神经夹伤模型，将这三种具有抗炎作用的药物直接应用于损伤的视神经周围，以验证其是否对视网膜神经节细胞有保护作用并促进轴突再生以及在视神经损伤局部缓释给药这一给药方式是否可行，为临床上外伤性视神经病变的治疗提供新思路。
实验方法：
通过喷涂法制备聚己内酯（PCL）-曲安奈德及他克莫司+奈帕芬胺缓释药膜，计算药膜中TA、FK506、Nepafenac的载药量，考察药膜体外药物释放行为。
选取73只SD大鼠，随机分为四组：正常组4只、对照组23只、实验组46只（PCL-TA给药组、PCL-FK506+Nepafenac给药组各23只）。大鼠左眼建立视神经夹伤模型，右眼不予处理。建模成功后，在视神经夹伤处沿轴向划开视神经鞘膜进行视神经减压。将药膜裁剪为3*1mm大小，放置于视神经夹伤处。通过以下指标对实验结果进行观察：（1）HE染色：观察大鼠视网膜及视神经的变化；（2）免疫组化：观察大鼠视网膜上caspase-3表达及视神经上GAP-43表达；（3）视网膜铺片及RGCs计数：做免疫荧光标记RGCs并计数；（4）FVEP：记录大鼠术前、术后3、7、14天的FVEP，分析N1、P1潜伏期变化。统计结果以均数±标准差表示，同时间点三组数据进行独立样本t检验，P＜0.05表明有统计学差异。
实验结果：
PCL-TA及PCL-FK506+Nepafenac缓释药膜的载药量分别为:57.4%、23.7%FK506+16%Nepafenac；TA、FK506、Nepafenac三种药物的体外药物释放分别为:在90天、90天及14天内三种药物在体外持续缓慢释放。
视网膜及视神经HE染色结果显示，正常视网膜中RGCs单层排列，密集、整齐,神经纤维平行束状排列，规则密集。随着损伤时间延长，对照组、TA给药组、FK506+Nepafenac给药组视网膜各层均变薄，RGCs逐渐减少，空泡样变性增多，但各时间点对照组比给药组RGCs更为稀疏。随着损伤时间延长，三组神经纤维逐渐稀疏，神经胶质细胞增生，各时间点对照组比给药组神经纤维排列更为紊乱、稀疏。
免疫组化结果显示，caspase-3在正常视网膜中几乎不表达，GAP-43在正常视神经中不表达。随着损伤时间延长，对照组、TA给药组、FK506+Nepafenac给药组视网膜caspase-3阳性细胞数量逐渐增多，各时间点两实验组视网膜中caspase-3阳性细胞数少于对照组。随着损伤时间延长，三组视神经中GAP-43阳性细胞数量逐渐减少，各时间点实验组GAP-43阳性细胞数多于对照组。
正常视网膜RGCs数量为（383.8±21.31）。对照组、TA给药组、FK506+Nepafenac给药组在损伤后3天RGCs数量分别为：（372.8±29.76）、（377.9±48.15）、（367.8±47.7）；损伤后7天RGCs数量分别为：（189.7±27.24）、（151.4±28.41）、（217.6±24.2）；损伤后14天RGCs数量分别为：（42.25±11.68）、（48.5±9.068）、（49.13±7.187）。实验组与空白对照组对比，损伤后3天两组P值分别为0.4777、0.8045(P＞0.05)，无统计学差异。损伤后7d两组P值分别为P＜0.0001、0.0015（P＜0.05），有统计学差异。损伤后14d两组P值分别为0.0323、0.0140，均小于0.05，有统计学差异。
正常大鼠FVEP中N1的潜伏期为（35.32±2.289）ms，P1的潜伏期为（55.7±4.173）ms。损伤后3天、7天、14天，给予PCL-FK506+Nepafenac组N1及P1潜伏期与对照组有统计学差异(P＜0.01)，相比对照组明显缩短。而给予TA缓释药膜治疗组N1及P1的潜伏期与对照组均无统计学差异。
实验结论：
1、在视神经损伤处局部给予PCL-TA缓释药膜对视神经有保护作用，可减少视网膜神经节细胞凋亡，但对缩短损伤后FVEP的N1、P1波潜伏期并无明显改善作用。
2、在视神经损伤处局部给予PCL-FK506+Nepafenac缓释药膜对视神经有保护作用，可减少视网膜神经节细胞凋亡，缩短损伤后FVEP的N1、P1波潜伏期。