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背景与目的 原位肝移植是现行治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病和代谢性肝病最为有效的方法。但是由于供体的缺乏，许多病人在等待肝移植时死亡。同时长期免疫抑制剂的使用也大大限制了原位肝移植的推广和应用。人工肝经40多年的研究，已开始用于临床，对改善终末期肝病患者症状、延长生命有一定作用。针对非生物型人工肝无法替代肝脏的合成及生物转化功能等问题，1987年Matsamura提出了生物人工肝(bioartificial liver support system，BLSS)的概念。生物人工肝作为肝功能衰竭有效的支持治疗手段和肝移植必要的辅助治疗措施，在前期临床研究中已取得了较好的效果，但是仍然存在许多问题。其中，作为生物人工肝核心部分的肝细胞来源依然是一个重要的课题。 骨髓中有两类干细胞，一类是造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，另一类是间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。骨髓MSCs具有干细胞的共性，也是一种具有多向分化潜能的细胞，在一定条件下能够分化为多种造血外组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞及神经胶质细胞等。成体骨髓MSCs是异质的，因为它们在形态上包括三种细胞类型，即纺锤状细胞、体积大呈扁平状的细胞和体积极小的小圆细胞。这些小圆细胞是MSCs的一个亚群，在培养过程中是最早出现的祖细胞，具有极强的向多系分化的潜能。 成纤维细胞生长因子-4(fibroblast growth factor-4，FGF-4)是一多肽，在体外能够刺激基质细胞生长，诱导基质细胞分化；在体内作为一种信号分子，在胚胎发育过程中对基质细胞的分化起着非常重要的作用。肝细胞生长因子郑州大学2003年硕士研究生毕业论文体外诱导人骨胜间充质干细胞亚群代决5租A-既细胞向肝细胞样细胞分化的研究(hepatocyte growth faetor，HGF)是一潜在的肝细胞丝裂原，受体是C一Met蛋白，在肝脏的生长和再生过程中起重要作用。体外HGF与c一Met一起可调节肝脏的形成，体内二者的结合对胚胎及胎儿期肝脏的生长发育起着至关重要的作用。 如果在体外能够诱导人骨髓间充质干细胞的亚群—{D45卫LA一DR一细胞向肝细胞样细胞分化成功，那么其临床应用前景非常广阔。首先，可推动生物人工肝和肝细胞移植的临床应用，治疗各种急、慢性肝功能衰竭和肝脏代谢性疾病，为临床上终末期肝病的治疗带来希望;其次，通过干细胞工程技术，为毒理学和药代动力学研究提供大量高质量的肝细胞，从而推动新药的研制和开发;第三，骨髓MScs取材方便，对机体无害，可取自体骨髓，因此由它诱导而来的组织细胞在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题，更易被患者接受和临床应用。 本研究的目的是观察HGF、FGF--4以及二者联用对培养的骨髓单个核细胞(bonemarrow Inononuclear cells，B孤州Cs)和CD45书LA一DR一细胞的作用，寻找影响和调节B呱州Cs、CD45书LA一DR一细胞向肝细胞样细胞定向分化的最佳条件，探讨体外诱导培养获取具有表型、功能和结构特征的肝细胞样细胞的可能性，从而为现代细胞工程学提供细胞来源。方法 收集无血液疾患的15一50岁的人的骨髓单个核细胞(bone marrow mononueleareells，BMMNCs)，用生长液[90%DMEM(低糖型)，10%FBS，100u/ml青霉素，100pg/ml链霉素〕进行培养，接种密度为5.0 X 105/m1。待细胞生长达对数生长期，用磁式细胞分离仪分选出CD45HLA一DR一细胞，改用维持液【98%DMEM(低糖型)，2%FBS，lx胰岛素一转铁素一硒混合物(普通型)，5 x 10一氢化可的松，5 x10舰2一疏基乙醇，lmg/ml BSA，4.7 pg/ml亚油酸，Zong/ml EGF，zoou/ml青霉素〕培养，并开始进行分组诱导。具体分组如下: A、对照组1:维持液+B呱州cs B、维持液+B孤州Cs+HGF(20ng/ml) C、维持液+BMMNCs+FGF一4(20ng/ml) D、维持液+BMMNCs+FGF一4+HGF(各20ng/ml) E、对照组2:维持液十CD45书以一DR一细胞 F、维持液+CD45邢LA一DR一细胞州GF(20ng/ ml) G、维持液+CD45习LA一DR一细胞+FGF一4(20ng/ml)郑州大学2(X)3年硕士研究生毕业论文体外诱导人骨翻间充质千细胞亚群代侧5刊以江肝细胞向肝细胞样细胞分化的研究 H、维持液+CD45HLA一DR一细胞+FGF一4+HGF(各20ng/ml) 以上各组细胞接种密度均为3.0 x IJ/m1，加入到预铺有纤维连接素的50ml塑料培养瓶中诱导培养，5ml/瓶，每3天换液一次。分别于诱导培养的第3、8、巧、22、30天留取细胞，进行透射电镜检测、制备细胞涂片进行免疫细胞化学、合成糖原的PAS法染色，同时留取培养上清，进行尿素氮功能的检测。结果 B、C、D、F、G、H六组第8天的细胞涂片均出现AFP、CK一19的表达，B、F组均与C、D、G、H组有显著性差异(P(0.05)，而B组与F组以及C、D、G、H各组间均无明显差异(P>0 .05)。随着培养时间的延长，AFP、CK一19的表达逐渐消失，而白蛋白、肝细胞抗原开始在胞浆内表达，在30天的细胞涂片除A、E两组阴性表达外，上述六组均出现白蛋白、肝细胞抗原的高表达，各组间的表达差异与诱导第8天时AF