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1.背景与目的:心肌纤维化（myocardial fibrosis）是一种重要而常见的病理过程,它在心脏功能从代偿到失代偿转变、心肌重塑从可逆到不可逆变化中发挥至关重要的作用。以基因治疗手段防治心肌纤维化,靶点的选择和基因转移的方式是非常关键的。研究发现心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）做为心肌间质纤维化的最终效应细胞,极有可能成为心肌重塑和心力衰竭的新治疗靶细胞。在CFs中找到一个合适的信号网络交汇点为靶点,可能对探索心肌间质纤维化防治措施具有重要意义和应用价值。钙依赖性酪氨酸激酶（calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2,Pyk2）在细胞内信号转导中占有重要地位,且我们前期实验已经证实Pyk2在心肌纤维化过程中发挥着显著的调节作用。钙依赖性酪氨酸激酶相关非激酶（Pyk2-related non-kinase,PRNK）是Pyk2基因由于剪接不同所产生的一个单独表达c端结构域的同源蛋白,可能在特定的细胞中选择性地调节着Pyk2的功能。基于以上背景资料,我们在实验中通过携带PRNK基因的腺病毒,从细胞模型和动物模型两个层面初步观察腺病毒载体技术能否有效、稳定的将PRNK转移至靶细胞;过表达PRNK是否可以有效的抑制Pyk2的磷酸化,从而减缓心肌纤维化的发展;初步探讨将带有PRNK基因的腺病毒靶向抑制Pyk2作为防治心肌纤维化的基因治疗手段之一的可能性,为深入研究Pyk2及PRNK对心肌纤维化的影响作用和分子机制提供理论依据。2.方法首先通过全基因合成PRNK基因编码区cDNA并将其插入腺病毒载体,构建带PRNK基因的腺病毒基因组重组质粒;转染293T细胞进行包装与扩增、纯化;测定病毒液滴度,行酶切鉴定,观察293T细胞的病变情况及荧光表达情况,Western blot法鉴定PRNK是否高表达。然后将PRNK腺病毒载体转染以血管紧张素Ⅱ（angiotentionⅡ,AngⅡ）诱导的大鼠心肌成纤维细胞。四唑盐比色法（MTT法）及流式细胞仪测定CFs细胞增殖及凋亡变化,并以化学比色法及酶联免疫吸附测定法（ELISA法）检测细胞培养上清中羟脯氨酸和Ⅰ型、Ⅳ型胶原分泌量的变化。Western blot法检测CFs中PRNK、磷酸化Pyk2的蛋白表达。最后将大鼠制备腹主动脉狭窄模型,分成分为4组:假手术组10只;PRNK腺病毒载体干预组10只,造模的一周后尾静脉注射PRNK腺病毒载体1ml;药物干预组10只,造模的一周后给予PPARγ激动剂罗格列酮100 mg·kg-1·d-1,腹腔注射;手术组10只,建立大鼠腹主动脉缩窄模型。术后5周,测定大鼠左室肥厚指数。心肌胶原Van Gieson染色后测量心肌组织胶原体积分数（collagen volume fraction,CVF）及心肌血管周围胶原面积比例（perivascular collagen area,PVCA）;并通过心肌胶原MASSON法特殊染色分析蓝染胶原含量。TUNEL法检测心肌组织中细胞凋亡变化。ELISA法检测心肌组织中Ⅰ型、Ⅳ型胶原分泌量的变化。Western blot法分析导入基因后各组大鼠心肌组织中PRNK及磷酸化Pyk2的蛋白表达。3.结果（1）成功合成PRNK功能片段,并构建了含有此片段的腺病毒载体。该重组腺病毒能使靶细胞有效表达PRNK蛋白。（2） PRNK腺病毒载体能以较高感染效率感染体外培养大鼠心肌成纤维细胞并稳定表达。（3）利用PRNK腺病毒载体感染CFs后,细胞培养上清中羟脯氨酸、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原检测值均明显低于对照组。MTT比色A值和流式细胞仪检测显示PRNK可显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导下的CFs增殖,并促进其凋亡。（4）利用PRNK腺病毒载体感染CFs可高表达PRNK,并可显著抑制由AngⅡ引起的Pyk2磷酸化。（5）将PRNK腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后,可引起PRNK组大鼠心脏左心室重量/体重下降。（6）将PRNK腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后,CVF和PVCA测得值、蓝色胶原灰度均显著低于对照组。心肌成纤维细胞凋亡率显著高于对照组。（7） PRNK腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后,心肌组织羟脯氨酸、Ⅰ型、Ⅳ型胶原检测明显低于对照组。（8） PRNK腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后,大鼠心肌组织高表达PRNK蛋白,而Pyk2磷酸化水平下调。（9） PRNK腺病毒载体干预组与给予PPARγ激动剂罗格列酮组比较,血清及心肌组织Ⅰ型、Ⅳ型胶原分泌量等指标无显著差异,都显著低于对照组。4.结论（1）本研究中,成功构建了PRNK腺病毒载体,并能在CFs和心肌组织中高表达目的基因,说明腺病毒技术可作为心肌纤维化机制及防治研究的有效基因转移手段。（2） PRNK腺病毒载体可显著抑制体外血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞的增殖,降低细胞合成分泌Ⅰ、Ⅳ型胶原和羟脯氨酸的含量,促进细胞凋亡。说明以PRNK靶向抑制Pyk2可能是防治心肌间质纤维化的新思路和有效途径。（3）将PRNK腺病毒载体经尾静脉注入大鼠心肌间质纤维化模型体内,可在心肌组织高表达,通过竞争性的抑制Pyk2磷酸化,从而抑制心肌纤维化,并且对心肌肥大也有一定抑制作用。这一研究结果初步验证了将带有PRNK基因的腺病毒靶向抑制Pyk2作为防治心肌纤维化的基因治疗手段之一的可行性。