黄萎病是世界性的棉花重大病害,严重威胁和阻碍着棉花生产的发展。本研究利用双向电泳技术分析了棉花在黄萎病菌胁迫下的蛋白质变化情况,并利用质谱技术对差异表达的蛋白质进行了肽质量指纹(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)分析。这不仅有利于丰富棉花抗黄萎病的生化基础,也可以由此进一步分析抗性蛋白质的氨基酸种类及其序列,为利用基因工程进行抗病育种提供重要依据。 本研究以棉花品种豫无620为材料,在接种黄萎病菌后提取叶片的蛋白质,建立起了一套适合棉花的蛋白质双向电泳的技术体系。首先利用改进的三氯乙酸/丙酮沉淀法提取棉花蛋白,增加丙酮沉淀次数至三次,得到浓度、纯度均较高的蛋白质样品。在第一向等电聚焦电泳中采用分步升压,最后聚焦总伏特数达到120000V左右的方法,结果达到较好的聚焦效果。对IPG胶条的平衡时间进行了摸索,采用第一步为20min、第二步为25min的平衡程序,从而减轻了第二向电泳中的蛋白质点纵向拖尾现象。之后采用T=12%的凝胶进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,采用低电流稳流进行电泳,取得了较好的结果。 通过对接种黄萎病菌后三个时间段的叶片蛋白质双向电泳图谱与对照图谱进行分析。结果表明,蛋白质点多分布在酸性区域,说明蛋白质多数属于酸性蛋白质。在三个时间段有不同数量差异表达的蛋白质,且有些蛋白点的表达量存在差异。在对接种后24h、48h、72h的蛋白表达图谱与对照的蛋白质图谱的比较分析中发现了三个共有的差异蛋白点。对这三个点进行质谱分析,再进行数据库查询,结果找到了与之具有同源性的蛋白质,分析可能与抗病反应有关。 (1)蛋白质点DB1与水稻中的DEAD/H box RNA helicase具有同源性,此类蛋白可能含有核苷酸结合位点,在细胞信号传导过程和宿主免疫调节中都有重要作用,可能在棉花对黄萎病的抗病反应中发挥一定的作用。 (2)蛋白质点DB2与丝氨酸蛋白酶抑制剂具有同源性,属于马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅰ家族。蛋白酶抑制剂在植物受到病原物入侵后会在植物体内富集,它可能会抑制病原物的蛋白水解酶。蛋白酶抑制剂具有防卫特性,在植物的防御机制中发挥作用。 (3)蛋白质点DB3与ODR--3蛋白具有同源性,此蛋白为G蛋白的α亚基,在与受体结合后可激活一定的信号传导途径,从而诱导棉花的一些防御反应。