川芎嗪是中药川芎的主要有效成分,具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用,广泛应用于心脑血管系统疾病的临床治疗。近年来研究表明TMP能透过血脑屏障,富集于脑,尤其是脑干,有很强的中枢作用。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成极性和水溶性较大的代谢物而迅速被排出体外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺点。经川芎嗪及其衍生物构效关系研究,证实吡嗪环为其基本药效基团；2,3,5,6位甲基为药代基团。在保留川芎嗪母核(吡嗪环)基本药效基团不变基础上,以氟桂利嗪的(4,4’-二氟)二苯甲基-1-哌嗪基甲基基团取代川芎嗪的2位甲基,合成出川芎嗪二苯甲基哌嗪(TMPDP)。氟桂利嗪(FLU)是临床上重要的心脑血管疾病治疗药物,(4,4’-二氟)二苯甲基哌嗪是其重要的活性基团。以氟桂利嗪的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团,以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点,并通过协同作用增强药效,提高抗心脑血管疾病作用。　　 本实验采用过氧化氢作为外源性自由基生成系统,模拟神经细胞的氧化损伤,建立离体培养的神经细胞(SH-SY5Y)氧化应激损伤模型,观察TMPDP对氧化损伤的神经细胞的保护作用及其可能的机制,为其用于脑血管疾病治疗提供进一步的资料,同时也为传统中药的开发提供新思路。　　 1.TMPDP对正常SH-SY5Y细胞存活力的影响　　 采用MTT法测定细胞活性,观察化合物对细胞增殖的影响。96孔细胞培养板中每孔接种100pl计3000个SH-SY5Y细胞,培养24h后,向培养孔中分别加入TMPDP与细胞共孵育,TMPDP溶液终浓度分别为5,10,20,40,80μmol·L-1。细胞继续培养12h后,每孔加入MTT溶液(5mg·ml-1)10μl,37℃孵育4h,终止培养,小心吸弃培养板中的液体,每孔加入100μl DMSO,振荡1min,使结晶物充分溶解。置酶联免疫检测仪上检测570nm处吸光度值(OD570)。结果发现SH-SY5Y细胞经不同浓度TMPDP作用12h后,低浓度时对细胞生存率无明显影响,与正常组相比不具有统计学意义。80μmol/L有降低细胞生存率的趋势,与正常组相比具有统计学差异(P<0.01)。　　 2.TMPDP对氧化损伤SH-SY5Y细胞存活力的影响　　 细胞与不同浓度化合物(5,10,20,40,80μmol·L-1TMPDP)孵育的同时,暴露于200μmol/L,的H2O2溶液中。采用等浓度的氟桂利嗪(FLU)作为对照,采用MTT法测定细胞活性。实验结果显示,SH-SY5Y细胞氧化损伤后,细胞活力显著降低(P<0.01),而TMPDP5、10、20、40μmol/L组细胞损伤抑制率明显高于相对应的5、10、20、40μmol/L FLU组,但80μmol/LTMPDP组则明显低于FLU80μmol/L组。故以下实验均采用5、10、20μmol/L三个浓度的TMPDP和10μmol/L FLU。　　 3.TMPDP对H2O2氧化损伤SH-SY5Y细胞LDH释放率的影响　　 收集氧化损伤处理后的各组SH-SY5Y细胞培养上清液和细胞裂解液,参照试剂盒说明分别测定培养上清液和细胞裂解液中的LDH活性,计算细胞LDH释放率。实验结果表明,SH-SY5Y细胞经H2O2损伤后,细胞活力降低,细胞膜通透性增加,胞内LDH漏出增多,培养液中LDH水平显著升高(P<0.01)。而5、10、20μmol·L-1的川芎嗪二苯甲基哌嗪处理后的细胞,细胞活力升高,LDH释放率明显减低(P<0.01),提示TMPDP对氧化损伤的神经细胞膜的完整性具有保护作用。　　 4.TMPDP体外抗氧化能力的检测　　 采用DPPH*法检测TMPDP体外抗氧化能力。DPPH*是一种稳定的自由基。加入不同浓度的抗氧化剂后,在516nm处的紫外吸光度会发生改变,用以检测化合物清除自由基的能力。我们选择了维生素E和TMP作为对照,发现120μmol/mLTMPDP对自由基的清除率为40％左右,提示TMPDP有中等程度的抗氧化能力。但其体外抗氧化能力不如维生素E,优于120μmol/mL TMP。　　 5.TMPDP对H2O2氧化损伤SH-SY5Y细胞内MDA含量、SOD活力和GSH含量的影响　　 收集氧化损伤处理后的各组SH-SY5Y细胞,加入细胞裂解液。参照SOD、GSH检测试剂盒说明分别测定细胞内GSH含量、SOD活力。实验结果表明,SH-SY5Y细胞经H2O2损伤后,培养液中SOD活力和GSH含量显著降低(P<0.01),MDA含量显著增加(P<0.01)。10、20μmol·L-1的川芎嗪二苯甲基哌嗪处理后的细胞,SOD活力显著升高(P<0.01),GSH含量显著增加(P<0.01),MDA生成量明显减少。TMPDP对H2O2所致SH-SY5Y细胞脂质过氧化损伤的保护作用呈现一定的剂量依赖性。另外,等剂量(10μmol/L)的TMPDP对三个指标的作用明显优于FLU,具有显著差异,说明TMPDP有更强的抗氧化损伤作用。　　 6.TMPDP对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响　　 6.1 TMPDP对细胞凋亡数目和形态的影响　　 将SH-SY5Y神经细胞接种于6孔细胞培养板,培养24小时后,经H2O2损伤同时加入TMPDP10μmol·L-1孵育12h。用Hoechst33258染色后,通过荧光显微镜观察细胞的形态变化。观察结果显示,Hoechst33258染色后,凋亡细胞核着色增强,染色体固缩并向核膜靠拢,DNA断裂成块状以及形成凋亡小体。而正常细胞的核(染色)质DNA疏松均匀,荧光染色后细胞核着色浅而均一。比较正常对照组、过氧化氢损伤组、TMPDP给药组(10μmol/L)SH-SY5Y细胞染色后细胞染色质形态的变化,发现氧化应激状态下的细胞易凋亡。细胞呈典型的凋亡形态,细胞核固缩并向核膜靠拢,染色质断裂、聚集,DNA断裂成块状,细胞核或细胞浆内可见致密的颗粒状强荧光,严重时细胞出泡形成凋亡小体。而TMPDP处理组细胞呈弥漫性均匀荧光,且荧光较弱,细胞核形态趋于正常,凋亡细胞数明显减少。提示H2O2氧化损伤后能明显诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡,而TMPDP可减少细胞凋亡的发生。　　 6.2 TMPDP对细胞内Caspase-3活力的影响　　 Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族,是细胞凋亡过程中的一个关键酶,是凋亡的最后执行者。Caspase-3蛋白活性的高低在细胞凋亡中具有显著意义。H2O2损伤后细胞内caspase-3活性显著增强,加入TMPDP的实验组其Caspase3活性明显降低,与氧化损伤组相比具有统计学意义(P<0.01)。表明TMPDP对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有显著的抑制作用。　　 7.TMPDP对H2O2氧化损伤SH-SY5Y细胞内钙离子浓度的影响　　 Ca2+参与细胞代谢的生理、病理过程,试验表明:脑缺血后出现的一系列病理生化改变,如ATP匮乏、膜去极化、离子泵衰竭、游离脂肪酸中毒等,都与细胞内Ca2+浓度升高有关。细胞内Ca2+超载可能是脑缺血后神经细胞死亡的关键所在。本实验中的化合物是在TMP的结构基础上修饰得到的,因TMP具有钙离子拮抗作用,故观察TMPDP是否也具有钙拮抗作用,以期解释该化合物对细胞的保护作用。结果发现:过氧化氢损伤后,SH-SY5Y细胞内钙离子浓度由正常组的159.0nmol/L升高至966.0nmol/L。给予5、10、20μmol/L TMPDP后,细胞内钙离子浓度分别降低至414.0nmol/L(P<0.01)、312.0nmol/L(P<0.01)和299.0nmol/L(P<0.01),呈现一定的剂量依赖性关系。FLU也呈现明显的钙拮抗作用,但等浓度的TMPDP的钙拮抗作用明显高于FLU。　　 8.TMPDP对H2O2氧化损伤SH-SY5Y细胞内NO含量和诱导型NOS(iNOS)活力的影响　　 NO对细胞凋亡具有双重调节作用。这种双重调节主要取决于NO的来源和生理浓度。NO的生物合成是在NO合成酶(NOS)的作用下,催化L-精氨酸而产生的。在脑缺血损伤、神经损伤过程中,诱导型NO合成酶(iNOS)来源的NO生成增多,NO可产生明显的神经毒作用。故本实验同时检测了NO含量和iNOS的活性,从而观察化合物TMPDP对神经细胞氧化损伤后细胞内NO含量的影响,分析化合物神经保护作用与NO的关系。　　 NO含量的检测结果表明:与正常组比较,H2O2氧化损伤组SH-SY5Y细胞内NO含量显著升高(P<0.01)。与H2O2损伤组比较,20μmol/L TMPDP可显著降低损伤细胞内NO含量(P<0.01)；10μmol/L FLU也可显著降低损伤细胞内NO含量(P<0.01)。iNOS活力的检测结果表明:与正常组比较,H2O2损伤组SH-SY5Y细胞内iNOS活力显著升高(P<0.01)。与损伤组比较,5、10和20μmol/L TMPDP可明显降低SH-SY5Y细胞内iNOS活性(P<0.05)；10μmol/L FLU也可显著降低SH-SY5Y细胞内iNOS活性(P<0.01)　　 通过H2O2氧化损伤体外培养的SH-SY5Y神经细胞,观察了TMPDP对神经细胞的保护作用。结果提示:TMPDP在体外有中等程度的抗氧化作用；在细胞内,对神经细胞具有较强的保护作用,能明显提高损伤后细胞内SOD和GSH水平,降低脂质过氧化产物MDA的生产,并减少细胞内LDH的释放,保护细胞膜的完整性；能够减少损伤细胞内DNA片段的产生,减少氧化损伤诱导的细胞凋亡数目,并显著降低凋亡执行蛋白Caspase-3的活力；具有较强的钙拮抗作用,并明显降低细胞内诱导型NOS的活性从而减少细胞内NO的生成。从而推测,TMPDP对神经细胞的保护作用机制可能与TMPDP抗氧化作用及对抗细胞凋亡作用密切相关。