论文部分内容阅读
漆酶（Laccase）是一种含铜的多酚氧化酶,具有广泛的底物,不仅能催化氧化多种芳香族化合物,还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质如苯氧基类除草剂等的毒性,还可以使多种染料脱色及去除工业废水的毒性。近年来在造纸、环保、食品、医药卫生、生物检测等领域有了较广泛的应用,因此对漆酶的研究具有重要的理论和现实意义。本研究利用愈创木酚平板筛选法,从山东省各地采集的朽木和土壤样品中分离得到一株产漆酶活力较高的真菌（菌株编号ZF-2）。本研究对该菌株进行了鉴定,利用响应面法对摇瓶发酵产酶培养基配方和发酵条件进行优化,利用粗酶液对活性艳蓝KN-R、结晶紫和刚果红进行脱色降解,并初步探讨氧化还原介质的添加和脱色条件对脱色效果的影响,主要研究结果如下:1. ZF-2菌株的鉴定通过菌体培养特征、形态学特征观察、5.8S rRNA序列测定及其系统进化树分析,鉴定ZF-2菌株为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）,该菌株的5.8S rRNA序列已在Gene Bank上注册,登录号为HM051191。2. ZF-2产漆酶的发酵培养基配方及发酵条件优化首先通过单因素筛选,确定了最佳碳源为麦草粉、最佳氮源为（NH4）2SO4和豆粕、最佳金属离子为Cu2+、最佳诱导剂为吐温-20,然后利用正交试验确定最佳C/N比。在此基础上,通过响应面法对发酵培养基进行优化,首先运用Plackett-Burman（PB）试验分析筛选出的各个培养基组分,以获得显著影响因子,然后通过最陡爬坡法接近最大响应区域,最后采用中心组合试验和响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。由上述方法确定ZF-2产漆酶发酵培养基的最佳配方为:麦草粉7.6 g/L、豆粕23 g/L、（NH4）2SO4 1 g/L、CuSO4 0.51 g/L、吐温-20 1 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 0.6 g/L。最佳发酵条件为:接种量2 %、发酵时间42 h、发酵温度28℃、装液量50 mL/250 mL、转速150 rpm,自然pH。运用优化后的发酵培养基和发酵条件进行摇瓶发酵,漆酶酶活达到72.549 U/mL,较基础发酵培养基漆酶活性提高56.33倍。3. ZF-2漆酶对染料的脱色降解初步探究了ZF-2漆酶在偶氮染料、蒽醌染料和三苯甲烷类染料脱色中的作用。用漆酶直接处理偶氮染料刚果红,反应5 h脱色率达到65.66 %,直接处理蒽醌染料活性艳蓝KN-R和三苯甲烷类染料结晶紫4 h,脱色率分别达到80.09 %和26.09 %。漆酶协同氧化还原介质（8-羟基喹啉、紫脲酸铵、L-羟基苯并三唑（HBT））对三种染料进行脱色降解,结果表明, 8-羟基喹啉和紫脲酸铵对三种染料的脱色率无显著作用,而添加HBT后,三种染料的脱色率均明显提高,活性艳蓝KN-R和结晶紫与漆酶/HBT反应4 h后,脱色率分别提高到92.87%和71.32%;刚果红与漆酶/HBT反应2 h后,脱色率提高到79.03%。对三种染料脱色条件的初步研究结果表明:漆酶降解活性艳蓝KN-R的适宜条件:pH值为5.5,温度50℃,漆酶用量15 U/mL时,脱色率较高,均在85%以上。漆酶降解结晶紫的适宜条件:pH值为5,温度50℃,漆酶用量20 U/mL时,反应3 h,脱色率最高,达到71.33%。漆酶降解刚果红的适宜条件:pH值为5,温度50℃,漆酶用量15 U/mL时,反应2 h,脱色率达到最大值,达到85.34%。