在真核翻译起始过程中,GCN2可以通过磷酸化真核起始因子eIF2来调控蛋白的翻译,这在机体应答逆境胁迫进行自身防御方面起到了重要的作用。在动物和酵母细胞中,GCN2基因的研究已经取得巨大进展。在植物中,GCN2的研究主要集中在拟南芥等模式植物中,进展缓慢。在烟草中,GCN2的研究则更少。本论文主要围绕烟草NtGCN2的克隆、原核表达和初步纯化以及其对生物(TMV)和非生物(SA、AZA信号物质)胁迫的响应等方面展开探索性研究,研究结果主要包括以下几个方面:首先,根据其它植物的GCN2序列保守区域设计引物,通过RT-PCR方法获得了NtGCN2的部分cDNA序列。采用RACE-PCR技术从烟草Nicotina tobaccum L.K326中获得了NtGCN2的5’/3’末端序列,序列经过拼接后获得了NtGCN2的全长cDNA序列,将其命名为NtGCN2(GenBank登陆号:KJ706220)。采用生物信息学软件分析发现NtGCN2基因的cDNA全长为4196 bp,开放阅读框ORF全长为3759bp,编码1252个氨基酸残基,分子量为141.4kDa,等电点为5.58。BLASTP分析结果表明NtGCN2与土豆和番茄的同源性分别达到90%和88%。对其蛋白质结构域进行预测发现NtGCN2包含了典型的GCN2激酶功能域。荧光定量PCR分析表明该基因在根、茎、叶和花中表达,在叶片中表达最强,根中的表达最弱。其次,为了研究NtGCN2蛋白的功能,我们构建了原核表达载体pET15b-NtGCN2并将该载体转化大肠杆菌BL21-codonplus-(DE3)-RIPL菌株进行原核表达。结果表明在0.5 mM和1 mM的IPTG诱导下,NtGCN2蛋白得到了表达。采用Western-Blotting对表达的蛋白进行鉴定。同时,对获得的可溶蛋白采用阴离子交换Hitrap柱进行初步纯化。结果表明,阴离子交换可以实现烟草GCN2蛋白的初步纯化。再次,为了检测NtGCN2重组蛋白的生化活性,我们克隆了 NtGCN2的底物NteIF2α的cDNA序列,并构建了原核表达载体pET15b-NteIF2α,并将其转化大肠杆菌BL21-Codon Plus-(DE3)-RIPL菌株进行原核表达。结果表明在0.5mMIPTG的诱导下,NteIF2α得到了很好的表达,同时采用Western-Blotting进一步鉴定。对获得的可溶性蛋白采用Ni2+-NTA琼脂糖柱进行初步纯化,结果表明该蛋白可以通过Ni2+-NTA琼脂糖柱进行初步纯化。采用阴离子交换对初步纯化的蛋白进行进一步纯化,结果发现该蛋白不能与阴离子交换柱进行结合,需要探索其它纯化方式。最后,我们采用水杨酸(SA)、壬二酸(AZA)和烟草花叶病毒(TMV)处理烟草K326进一步研究NtGCN2基因对生物和非生物胁迫的响应。结果表明:NtGCN2可以受到TMV的诱导,并且在接种TMV12h，NtGCN2的表达量明显提高。另外NtGCN2可以受到SA的诱导,并且SA处理12 h和24 h后,NtGCN2的表达量明显提高,36 h后恢复正常。同时,SA处理48 h后接种TMV的结果发现,在TMV接种后12小时NtGCN2基因的表达量进一步增强,该结果表明SA处理和TMV接种后,TMV进一步激活了NtGCN2基因的表达。此外,采用不同浓度的壬二酸(AZA)对苗期烟草进行处理,结果表明NtGCN2的基因表达也受到了 AZA的诱导。AZA处理后12 h,0.1 mM和1 mM浓度的AZA显著激活NtGCN2的表达,其中1 mMAZA的激活作用较0.1mM的明显。处理后12h后1mM浓度处理的NtGCN2表达量最高。进一步采用壬二酸对团棵期(10-12片真叶)烟草进行处理。研究结果表明团棵期NtGCN2对AZA的响应规律与苗期相似。本研究首次在烟草中克隆到了NtGCN 的cDNA序列并成功进行了原核表达和初步纯化,为植物中GCN2的功能研究奠定了基础。同时本研究初步探索了 NtGCN2基因对生物和非生物胁迫的应答,为深入研究GCN2的介导的胁迫应答机制提供了理论依据。