研究背景骨肉瘤作为一种恶性肿瘤,不同于肝癌、肺癌等,最好发于儿童和青少年,是年轻人最常见的恶性肿瘤。恶性程度高,血运丰富,极易发生转移及复发,预后极差,死亡率高。1970年以前采用单纯手术治疗方法,生存率不足20%【1】。近几十年来,虽然采用新辅助化疗和保肢手术相结合的方式,但是5年生存率仍仅65%左右【2】。因此,寻找一个能判断临床预后的指标显得非常重要。传统的临床预后因素虽然能在一定程度上反应患者的预后情况,但其缺乏统一的标准和测量方式,这也在一定程度上限制了其进一步发展。随着对肿瘤研究的深入,对肿瘤发生发展机制的进一步研究,分子预后指标逐渐突显出优势,成为判断临床预后的新的研究方向。目前已经有一部分分子指标,如P-glycoprotein[3], CXCR4[4], uPA/uPAR[5]和survivin[6]已经证实可以作为肿瘤对化疗反应及临床诊断转移的预后指标。RECK (reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motif)基因是1998年由日本学者Takahashi等在v-ki-ras转染的细胞株NIH3T3中通过表达克隆方法新发现的一种转录抑制基因。RECK基因位于人9p12-p13染色体,整个基因长度约87kb,其中包括21个外显子和20个内含子,共有13个单核甘酸多态性(SNP),其转录子大小为4.6kb。RECK基因共编码971个氨基酸,其编码的蛋白质相对分子量大小为110kDa,其中半胱氨酸含量高达9.2%；NH2-端和COOH-端有2哥疏水区域,在NH2端由5个半胱氨酸重复结构与5个潜在的糖基化位点,COOH-端由疏水的糖蛋白I(GPI)锚定信号,固定RECK于细胞膜。具有很好的肿瘤抑制作用【7】。肿瘤的侵袭和转移主要靠细胞外基质的降解,而细胞外基质和基底膜的降解主要依靠蛋白水解酶的作用,目前已发现多种蛋白水解酶,如基质金属蛋白酶、天门冬氨酸蛋、白酶丝氨酸蛋白酶和半胧氨酸蛋白酶。其中基质金属蛋白酶(matrix metalloprpteinases, MMPS)是目前已知的与骨肉瘤的侵袭、转移密切相关的一类重要的蛋白酶,能降解细胞外基质大部分成分。RECK基因对基质金属蛋白酶的具有作用,从而抑制细胞外基质的降解达到抑制肿瘤侵袭、转移的目的。许多肿瘤的侵袭、转移都伴随着RECK基因的低表达或不表达。研究表明,RECK在许多恶性肿瘤中低表达,如乳腺癌【8】、胰腺癌【9】、胃癌【10】、膀胱移形细胞癌【11】、肺癌【12】,其中,高表达患者的预后要明显好于低表达患者,作为一种独立的因素,其表达的高低与患者的预后明显相关。在骨肉瘤中,我们较少看到这方面的报道,仅有部分研究显示骨肉瘤中RECK1低表达,并证实了在体外恢复表达后,RECK具有抑制转移的作用。本实验前期部分由徐建达完成,通过检测骨肉瘤中RECK蛋白的表达,证实RECK基因在骨肉瘤患者中表达明显减低,与患者临床预后具有显著相关性。本次实验旨在通过RT-PCR技术,对骨肉瘤中组织中RECK基因进行半定量检测,更精确的探讨RECK基因的可能作用机制及其与患者临床相关因素关系【13】。目的探讨RECKmRNA与MMP-2mRNA在骨肉瘤中的表达情况探讨RECKmRNA与MMP-2mRNA与骨肉瘤临床相关因素关系材料和方法病例资料来源：45例病人均取自我院2001年2月-2006年4月术中所取组织,经我院病理科证实均为骨肉瘤病人。45例病理中,男性32例,女性13例,年龄4-55,平均年龄19.2岁,病变部位位于股骨远端25例,胫骨近端20例。所有病人均采用新辅助化疗加手术治疗方案,化疗方案参照T12方案,化疗药物包括甲氨喋呤、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺。病人术前化疗2次,术后6次。未完成全部化疗的不予入选。随访周期定义为出现症状诊断为骨肉瘤到患者死亡或者最后一次随访间隔时间。1.1本实验病例入选标准1)经病理科证实为骨肉瘤2)初诊时无转移病灶3)均未经特殊治疗4)采用新辅助化疗方案(术前2次和术后6次化疗)5)接受了正规手术治疗6)所取标本均可用于RT-PCR检测1.2病例排除标准.1)未接受全程标准化治疗的患者2)化疗前胸部X片证实已经肺部转移者3)未接受正规手术病灶切除术者4)接受化疗后因各种原因而终止治疗者2原理RT-PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用目的基因及参考基因引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。3主要试剂、仪器及方法3.1试剂及仪器Trizol购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒PrimeScript(?)RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)及PCR扩增试剂盒SYBR(?)Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)均采用TaKaRa公司试剂盒,购自宝生物(大连)有限公司。ABI7300Real-Time PCR System购自美国ABI公司。3.2引物设计引物由invitrogen公司合成,引物设计见参考文献及国际互联网cDNA文库,由英骏生物技术有限公司引物合成。RECK:(上游)5’2CCT2CAGTGAGCACAGTTCAGA23’(下游)5’2GCAGCA2CACACACTGCTGTA23’; MMP-2:(上游)5’2GATGCCGCCTTTAACTGG23’,(下游)5’2TCAG2CAGCCTAGCCAGTCG23’ GAPDH:(上游)5’2CCCATCACCATCTTCCAG23’,(下游)5’2CAGTCT2TCTGGGTGGCAGT23’3.3RNA的提取、cDNA的制作及Real Time PCR反应取约O.1g标本置于研钵中,加入Trizol1.OmL,严格按照Trizol说明书进行操作提取RNA。提取后用分光光度计法检测RNA浓度及纯度,OD值1.8-2.0为合格。按试剂盒说明进行逆转录：①基因组DNA的除去反应：42°2min→4°,②反转录反应：37°15min→85°5sec→4°(反应液在冰上配置)。Real Time PCR反应条件：①预变性：95°30sec②PCR反应：95°5sec60°30sec,40个循环。反应结束后计算机自动得出阈循环(Cycle threshold, Ct)值。循环结束后绘制扩增、溶解曲线。△Ct=Ct目的基因一Ct内参基因。△Ct值越大,表明基因表达量越小。4.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析。定量资料结果采用均数±标准差(χ±8)表示,两独立样本间比较采用成组t检验或Satterthwaite校正t检验。绘制RECK与MMP2基因两变量的散点图,二者的相关性分析采用Pearson相关性分析。单因素分析中,以是否复发和转移为临床因素,采用kaplan-meier法计算其5年生存率和中位生存时间,组间比较采用log-rank检验。多变量分析采用COX回归法,以入选患者最终的生存结局作为应变量,以年龄、性别、肿瘤部位、组织业型、是否转移、是否复发、RECK含量和MMP2含量作为自变量,采用逐步法,入选变量显著性水平α=0.05,剔除变量显著性水平α=0.10,获取有统计学意义的回归模型,并给出各变量的优势比(OR)及其95%可信区间。以P≤0.05为差别有统计学意义。5.结果结果显示提取的RNA完整性好。目的基因RECK、MMP-2及标本内参照基因GAPDH扩增产物的融解曲线均为单一峰,表明扩增产物单一；扩增曲线拐点清楚,指数期明显,且说明扩增良好。5.1RECKmRNA、MMP-2mRNA与临床相关特点之间的关系通过统计分析发现RECKmRNA表达与转移(p=0.003)及复发(p=0.01)具有显著相关性,而与年龄、性别、肿瘤部位及分型无关(p=0.966,P=0.263,P=0.993,P=0.835)。MMP-2mRNA基因与骨肉瘤的转移(p=0.001)及复发(p=0.029)具有显著相关性,与年龄、性别、肿瘤部位及分型无关(P=0.420,P=0.337,P=0.856,P=0.390)。RECKmRNA与MMP-2mRNA的表达呈明显负相关性(r=-0.700,p=0.000)差异。5.2RECK与临床预后及生存期之间的关系分析显示RECK与患者5年生存期具有显著相关性(p=0.000)。采用多因素分析可能有意义的变量。研究发现RECK表达可以作为骨肉瘤预后的一个独立预后因素(P=0.022)。结论：1.在骨肉瘤组织中,RECKmRNA的表达与MMP-2mRNA的表达具有明显的负相关性。骨肉瘤组织中,RECKmRNA及与MMP-2mRNA的表达与患者复发、转移及5年生存期有关,而与与患者年龄、性别、肿瘤部位、组织亚型无显著相关性。2.本组研究结果证实RECK为影响患者生存时间的影响因素,并可作为预测骨肉瘤预后的重要参考指标,同时也为个体治疗方案的选择提供重要依据。