共生真菌(symbiotic fungus)广泛存在于植物中,通过与植物建立共生关系,促进宿主形态发育、体内代谢产物累积,提高植物抗性,不同种类的共生真菌对植株的促进效应具有潜在特异性。铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)在我国药用历史悠久,其药用价值高,药食兼用,它的生长发育都与共生真菌密不可分。目前铁皮石斛野生资源极度濒危,人工栽培有效成分含量低,仿野生栽培环境耐受性差。由于温室效应和夏季连续高温致使铁皮石斛的生长受到严重影响,严重制约了铁皮石斛产业在重庆的发展。介于共生菌对兰科植物具有优良的促生作用,本研究力图从铁皮石斛种子中分离共生菌,探索该共生菌与石斛苗的共生关系建立、对石斛苗营养生长和耐高温的影响,为培育耐高温、高药用价值的石斛种苗和石斛生物菌肥的研发提供理论依据,助推重庆铁皮石斛产业发展。为此设计以下试验:从野外摘取铁皮石斛成熟未开裂蒴果,表面消毒后,无菌条件下播种于MS基础培养基中,培养至有菌落出现,挑取瓶内菌丝,在PDA平板上进行划线分离和纯化。将纯化后的菌株平板切成0.5ⅹ0.5cm见方的小块,以1块/株的密度接种于无菌组培苗根际,培养30d-90d。通过观察接种石斛苗生长受到抑制或促生的形态学差异,筛选出与石斛根系共生的菌根菌,并从形态学和分子生物学水平对筛选到的菌根菌进行鉴定。为进一步验证筛选出的菌根菌是有益菌株,将该菌株重新接种到无菌石斛苗根际,培养60d,随后分别在适温(25/15℃)、低高温(30/20℃)、中高温(35/25℃)和高温(40/30℃)4种昼/夜温差处理下共培养,光照强度为1700lx-2000lx,光照时间12h/d,对照不接菌,胁迫培养20d。比较植株的高温半致死温度,测定菌根化石斛苗形态指标和各项抗性生理指标。试验结果如下:一 铁皮石斛种子内生菌的分离鉴定从铁皮石斛种子培育小苗体系中获得7株真菌,其中3株致死菌,接种会导致石斛苗死亡;2株机会菌,接种后不促进石斛苗生长,但不死亡;2株为有益菌记为J1和J2,接种后促进石斛苗的生长。J1菌落呈橄榄绿,无纹理结构,J2为淡绿色,正面有放射状不规则分支裂纹,成熟菌落均布满黑色孢子;2株菌均为有膈分枝菌丝,具有球形或卵圆形分生孢子。PCR扩增序列BLAST比对结果,J1与Cladosporium sp.BMP2947匹配度100%;J2与Cladosporium halotolerans匹配度99%,两株共生菌同属于枝孢属,在共培养的石斛苗根细胞内观察到了清晰的菌丝团,为兰科菌根特征,因此,J1和J2鉴定为兰科菌根真菌(Orchid mycorrhizal fungi,OMF)。二 OMF对石斛苗高温半致死温度的影响铁皮石斛组培苗叶片的细胞伤害率与逐渐升高的胁迫温度之间基本符合Logistic方程,具有典型的“S”型生长反应曲线,高温胁迫与细胞伤害转化值之间达显著水平后,方程系数R~2>0.9,方程拟合良好。通过Logistic方程计算,接种OMF提高石斛苗的高温半致死温度0.436-7.27℃。三 接种OMF石斛苗耐高温胁迫的抗性机制1接种OMF促进石斛苗营养生长与对照相比,接种OMF对铁皮石斛营养生长都有显著的促进作用,促进石斛苗鲜重和干重的累积,但J1和J2对幼苗促生作用部位有差异。J2主要促进铁皮石斛根的伸长、侧根的形成和茎的加粗,植株根系发达,茎粗壮。根长增加可达44.15%,茎直径增加可达53.23%。J1主要促进植株长高和叶面积增大,植株细长,叶片大,株高最多增加17.84%,叶面积增加可达83.02%。2接种OMF对石斛苗耐热胁迫生理活性活性的影响与对照相比,接种OMF(J1和J2)显著降低了高温下铁皮石斛叶片的水分饱和亏,提高了植株的保水能力;相对叶绿素含量和净光合速率显著上升,胞间二氧化碳浓度显著下降,提高了植株的光合能力;叶片保护酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶)活性显著增强,丙二醛含量显著下降,渗透调节物质(可溶性糖和可溶性蛋白)含量显著上升,高温半致死温度显著提高,铁皮石斛组培苗的耐热性得到显著增强。四 接种OMF促进石斛苗茎的增粗生长和石斛多糖的合成与对照相比,在三个试验高温胁迫温度下,接种OMF石斛苗茎的增粗分别为28.18%、26.34%、26.59%和21.54%;多糖含量分别增加20.57%、35.73%、28.69%和29.07%。接种OMF能显著促进石斛苗石斛多糖的合成,J1和J2最高分别提高51.35%和82.65%。与J1相比,J2菌株在提高石斛苗药用部位“茎”的生长发育和药用成分“石斛多糖”的累积更加优良。