稻瘟病是在世界各水稻产区广泛发生、危害极大的真菌性病害,深入研究稻瘟病菌的致病机理有助于发现控制稻瘟病及其它真菌病害的新途径。尽管已有许多研究从不同的角度解析了稻瘟病菌的致病机理,但是关于基因转录后调控在稻瘟病菌致病性中所起作用的研究还很缺乏。在前期工作中,本实验室的研究人员通过筛选从稻瘟病菌的ATMT突变体库中获得一株在OTA平板上生长缓慢的突变体LF13,遗传杂交分析表明该突变体的生长缺陷与潮霉素抗性标记共分离,基因组Southern杂交也证实T-DNA在突变体LF13中是单拷贝插入的。通过TAIL-PCR的方法获得了 T-DNA插入位点的侧翼序列,并将该插入位点定位于基因MGG01781.6转录起始位点上游1004bp和478bp的位置,并造成了 525bp的片段丢失,本文将该基因命名为PCG6。作者通过SMART网站和InterPro进行结构预测以及cDNA克隆,确定该基因编码的蛋白长度为964氨基酸,包含5个KH结构域。BLAST查询显示,Pcg6可能是一个RNA结合蛋白,其同源蛋白在其它丝状真菌中广泛存在、高度保守。为了确定PCG6基因在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的作用,作者首先分析了通过同源重组方法获得的PCG6基因敲除体的生物学表型。与野生型菌株相比,PCG6基因的敲除体对大麦和水稻的致病力显著下降。显微观察显示,PCG6对稻瘟菌的生长、产孢和致病性等的影响具有多效性,该基因敲除体呈现菌丝生长缓慢、产孢减少、附着胞形成率下降、侵染率下降和侵染菌丝的扩展受阻等多种缺陷。为了确定Pcg6蛋白的亚细胞定位情况,作者构建了自身启动子控制的PCG6-eGFP融合表达载体pLPCG6,并将该载体转化至PCG6基因的敲除体k3中,获得了 10余个生长、产孢和致病表型均恢复至野生型的互补转化子,包括k3C。显微观察显示,绿色荧光信号均匀地分布于k3C营养菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵染菌丝的细胞质中,因此,作者认为Pcg6是一个定位于细胞质中组成型表达的蛋白。pBLAST查询显示,Pcg6蛋白与玉米黑粉菌的Khd4蛋白有32%的一致性。据报道,玉米黑粉菌的Khd4蛋白能结合AUACCC这一顺式元件。为了确定Pcg6也像Khd4 一样具有类似的结合活性,作者通过EMSA实验证实Pcg6也能特异结合AUACC序列。为了揭示直接与Pcg6蛋白结合的靶标mRNA,作者通过RNA-seq深度测序比较了野生型P131和PCG6基因敲除体k3的转录组数据,将含有AUACC基序并且上调或下调至少两倍以上的基因挑选出来,最终获得了可能直接受到Pcg6调控的2225个上调基因和1129个下调基因。随后,作者采用qRT-PCR的方法对RNA-seq的数据进行了验证,结果表明所有用于验证基因的mRNA累积水平与RNA-seq的数据结果一致。按照KEGG代谢途径将受Pcg6蛋白调控的基因进行归类,结果显示,有功能注释的基因大多参与了氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂代谢,因此,作者认为,Pcg6对于稻瘟病菌体内生物大分子的代谢起着重要的调控作用。在所有这些受Pcg6蛋白直接调控的基因中,一群参与谷氨酸代谢的基因引起了作者的关注。参与谷氨酸代谢路径的大部分基因的mRNA含有Pcg6蛋白的结合基序AUACC,并且在k3菌体内积累水平显著上调,尤其是MGG07187、MGG14279和MGG 08074等谷氨酸合成和代谢的关键基因。为此,作者通过HPLC定量检测了菌体内氨基酸含量的变化。结果显示,在PCG6基因敲除体k3菌体内谷氨酸含量降低,谷氨酰胺含量升高。为了探究k3的缺陷表型与菌体内氨基酸含量变化的关系,作者分别对谷氨酸合成酶编码基因MGG07187进行了超表达和敲除,对谷氨酰胺合成酶编码基因MGG14279和谷氨酸脱氢酶编码基因MGG08074进行了超表达。结果显示,敲除MGG 07187导致菌体内谷氨酸含量减少,产孢减少,附着胞形成率降低,侵染率下降,最终导致致病力减弱。而且,MGG07187敲除体在营养匮乏的基础培养基上不能生长,通过外源添加谷氨酸的方式可以恢复MGG 07187敲除体的缺陷表型。超表达MGG 14279和MGG08074均会导致菌体内谷氨酸含量的减少,同时菌落生长缓慢,产孢极少和致病力减弱。上述结果表明,保障稻瘟病菌体内谷氨酸含量的平衡对于稻瘟菌维系正常的生长、发育和致病性是非常重要的。此外,作者还发现大量含有AUACC基序的致病相关基因在PCG6敲除体k3中的mRNA积累显著下降,包括MPG1、PTH11和P7H12等三个参与附着胞形成的cAMP信号途径的重要基因。随后,作者在k3分生孢子悬液中分别添加了 cAMP和IBMX,并将其接种于疏水玻片和大麦叶片,结果发现cAMP和IBMX添加能将k3的附着胞形成缺陷和侵染缺陷均恢复到正常野生型的水平,表明Pcg6蛋白可通过正调控参与cAMP信号路径的致病蛋白的表达从而影响菌体的致病能力。在本研究中,作者发现一个含有多个KH结构域蛋白Pcg6在稻瘟病菌菌丝生长、分生孢子产生和致病性中起重要作用,并发现该蛋白对谷氨酸合成相关基因mRNA的累积有负调控作用,对cAMP信号途径基因mRNA的累积有正调控作用,尤其是谷氨酸合成相关基因mRNA的过量累积导致稻瘟病菌菌丝生长缓慢、分生孢子产生显著减少、致病力显著减弱。本研究为深入认识稻瘟病菌致病性的分子机理提供了新的视角。