论文部分内容阅读
前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是好发于老年男性的生殖系统肿瘤,PCa的发生与发展和雄激素及其受体的变化密切相关。雄激素与雄激素受体(Androgen Receptor ,AR)作用,通过自分泌或旁分泌途径,调控前列腺上皮细胞生长及分泌,维持正常细胞增殖和凋亡的相对平衡。随着年龄增大,雄激素水平降低,会造成生殖细胞内分泌功能异常,细胞增殖和凋亡功能失衡,是导致PCa发生的重要原因之一。AR作为PCa组织中雄激素依赖细胞的一种标志,其发生突变或免疫表型缺失会造成AR对配体识别的特异性改变,影响AR转录激活特性,导致AR功能受抑制或失活,造成下游各种生长因子及受体表达异常,癌基因激活和抑癌基因的失活。这些调控因子的异常表达与前列腺癌的生长失控密切相关,使癌细胞逃避AR信号通路的增殖抑制作用,导致雄激素非依赖性PCa的发生,从而促进PCa的发展及内分泌治疗的失败。增殖细胞核抗原(PCNA)与Ki67能特异反映细胞周期中的增殖活性。核仁组成区(AgNORs)通过反映DNA非整倍体变化及核糖体的功能,进一步反映肿瘤的生长速度及分化程度。表皮生长因子受体(EGFR)具有受体型蛋白酪氨酸激酶活性,介导细胞增殖活化信号,调节细胞生长与浸润。前列腺癌AR表达缺失可能通过影响这些增殖因子的表达,影响细胞增殖效应。BCL-2作为抗凋亡基因,通过与促凋亡基因Bax形成异二聚体,调控细胞凋亡的动态平衡,BCL-2及Bax的表达水平及比值决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡。雄激素及其受体信号途径参与调控了BCL-2的表达水平及活性,AR表达缺失会影响PCa的凋亡效应。因此有目的比较AR正常与缺失两组PCa的病理学差异,探讨前列腺癌AR与增殖和凋亡相关因子表达的相关性,有助于了解AR对PCa增殖和凋亡的影响。为研究AR与PCa增殖和凋亡的关系,本课题收集人体113例前列腺癌标本113例及良性前列腺增生(BPH)标本10例(对照组),和前列腺癌细胞株LNcap(雄激素依赖性PCa,AR表达)和PC-3(雄激素非依赖性PCa,AR不表达)作为研究材料,应用多种免疫组化标记、细胞培养、RT-PCR分析,结合光镜、电镜观察及图像分析等方法,系统研究AR与PCa增殖和凋亡的相互关系,重点探讨以下几方面问题:(1)、应用AR免疫组化标记,研究在不同分化PCa组织中AR的表达特点,分析PCa中AR表<WP=10>达〔AR(+)〕组及AR不表达〔AR(-)〕组的形态学差异,重点探讨PCa中AR免疫表型突变与PCa病理形态学变化的相关性。(2)、应用细胞增殖相关因子Ki67、PCNA、AgNOR、EGFR等标记物,检测它们在AR(+)组/AR(-)组PCa中的表达特点,探讨AR表达与PCa细胞增殖的相关性。(3)、应用细胞凋亡相关因子BCL-2、Bax及Tunel等标记物,观察它们在AR(+)组及AR(-)组PCa中的表达特征,探讨BCL-2、Bax及Tunel与AR及细胞凋亡的相关性。4、应用不同水平DHT刺激LNcap和PC-3细胞株,检测EGFRmRNA及蛋白、Tunel在不同AR表达的PCa中的表达特点,研究雄激素及AR与PCa增殖和凋亡的相关性。探讨AR免疫表型突变影响PCa增殖和凋亡效应变化的分子机制,为PCa的病理及临床提供实验依据。主要结果和结论如下: 113例前列腺癌AR免疫组化标记AR(+)61例,AR(-)52例,AR不表达率约为46.02%,高于国外报道的20%(20),应用Gleason分级比较发现AR(+)组高分化癌26例,中分化癌23例,低分化癌12例,癌细胞总体分化较好;AR(-)组高分化癌7例,中分化癌15例,低分化癌30例,癌细胞总体分化相对较差。前列腺癌AR(+)组Ki67、PCNA表达较AR(-)组标记阳性指数低,阳性表达弱;AgNOR标记AR(-)组较AR(+)组数目增多,形态不规则颗粒增多;AR(-)组EGFR标记较AR(+)组表达增强。光镜、电镜观察结果显示AR(-)组细胞增殖作用较AR(+)组明显增强,提示AR突变,造成PCa细胞的无限增殖能力增强,细胞生长迅速,异质性更明显,可能是PCa难于治疗的原因之一。通过BCL-2、Bax及Tunel标记,结合光镜、电镜观察表明,随Gleason分级增高,BCL-2阳性表达明显增强,Bax表达增强,BCL-2/Bax比值增高,Tunel阳性率增高。AR(-)组较AR(+)组BCL-2阳性表达明显增强,Bax表达增强,BCL-2/Bax比值增高,Tunel阳性率的增高进一步反映了AR(-)组细胞凋亡效应增强。组织病理学观察也发现AR(-)组较AR(+)组凋亡作用增强,且随Gleason分级增加凋亡作用增强。提示AR表达缺失促进了BCL-2和Bax的表达,BCL-2和Bax与AR表达有相关性,Bax表达上调促进细胞凋亡的发生,而BCL-2有癌基因的作用,其表达上调则抑制细胞凋亡,间接促进了的细胞增殖。不同水平DHT(0-10-8M)处理LNcap及PC-3细胞24h和48h后RT-PCR方法扩增EGFRmRNA片断,经电泳分析发现,EGFR在LNcap细胞中DHT10-10M表达较强,48h稍高于24h,在PC-3细胞中,DHT10-10M及不加DHT组EGFRmRNA表达无显著差异,均较高,10-8M及10-9M组表达较低,同时发现DHT10-10M作用于PC-3<WP=11>细胞的EGFRmRNA水平明显高于LNcap细胞,MTT结果显示低水平DHT促进LNcap细胞增殖,DHT水平升高增殖活性下降,不加DHT组增殖活性较低。低水平DHT与不加DHT对PC-3细胞增殖活性影响不大,高水平DHT刺激增殖活性略有下降。实验结果表明低水平DHT促进LNcap细胞EGFRmRNA的表达,促进LNcap细胞增殖,随DHT水平升高表达下降,增殖活性下降,不加DHT组EGFRmRNA表达较低。表明在AR正常表达情况下,雄激素可提高LN