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研究背景及目的脓毒症（sepsis）是感染引起的全身炎症反应,能导致脏器功能障碍。急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病理生理机制是肺泡上皮屏障功能破坏、肺毛细血管内皮细胞损伤,导致非心源性肺水肿。脓毒症ALI可见血浆、肺组织细胞因子升高,血管及肺泡内纤维蛋白沉积,肺毛细血管液体渗漏增加。紧密连接蛋白是维持细胞旁物质选择性通过、增强细胞屏障功能的重要成分。体外实验发现紧密连接蛋白claudins、occludin、ZO-1的表达受到炎症因子、生长因子、凝血酶等外界刺激的影响,发生表达下调或向胞浆内移位,导致紧密连接功能异常或结构破坏。肝素类药物不仅能发挥抗凝作用,还能与炎症因子、趋化因子、补体相互作用,参与机体免疫反应,产生抗炎作用。脓毒症、感染性休克、脓毒症DIC病人应用肝素治疗能降低死亡率。用普通肝素或低分子肝素处理内毒素血症小鼠或大鼠,能减轻炎症反应及器官损伤,提高生存率。目前关于紧密连接维护细胞屏障功能的研究主要涉及神经系统肿瘤及感染、消化道肿瘤及炎症、呼吸系统炎症、糖尿病视网膜病变,而脓毒症导致的急性肺损伤是否有紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的参与,以及普通肝素是否通过保护紧密连接而治疗脓毒症ALI,目前尚不清楚。本研究通过盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠ALI模型,观察紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1是否存在表达异常,探讨普通肝素是否通过保护紧密连接蛋白减轻ALI肺水肿表现。在体外建立人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）单层,研究普通肝素能否通过保护紧密连接减轻脂多糖诱导的HLMVECs渗漏现象,初步探讨普通肝素的这一作用机制是否有ERK1/2 MAPK的参与。研究方法一、动物模型制备及分组45只雄性Wistar大鼠,随机分成3组,对照组（n=15）,脓毒症组（n=15）,脓毒症肝素治疗组（n=15）。对照组进行假手术,脓毒症组、脓毒症肝素治疗组行盲肠结扎穿孔术。脓毒症肝素治疗组在术前30分钟皮下注射普通肝素1000U/kg,术后12小时追加同样剂量普通肝素一次。对照组、脓毒症组在相同时间点皮下注射与脓毒症肝素组等体积的生理盐水。另取33只大鼠观察生存率,每12小时记录一次生存情况直至96小时。二、标本收集及处理大鼠麻醉后,行单侧支气管肺泡灌洗,回收灌洗液,离心吸取上清,分装后-80℃保存,用于ELISA检测。取左肺组织测湿干重比。切取少许右肺下叶组织块,2.5%戊二醛固定,用于透射电镜观察。余右肺下叶以4%多聚甲醛固定,用于石蜡切片、HE染色、免疫组织化学染色。右肺中叶以液氮速冻后,再-80℃保存,用于western blot检测。为评价肺微血管液体渗漏情况,予大鼠静脉注射1%伊文氏蓝溶液,1小时后处死,生理盐水灌洗肺血管后,取左肺并以超声破碎。三、细胞培养方法人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）购自上海拜力生物科技有限公司。用DMEM高糖培养基（含1%青链霉素）+10%胎牛血清,于细胞培养箱37℃、5%CO2条件下培养,每2天换液1次,培养3-4天处于对数生长期,且达到80-90%融合,可进行后续实验。用PBS、LPS、普通肝素、ERK抑制剂（U0126）分组处理细胞后进行检测。四、实验方法1.动物水平（1）HE染色观察肺组织病理表现。（2）ELISA检测BALF中IL-6含量,评估肺组织炎症反应。（3）测肺湿干重比评估肺水肿情况。（4）测定肺组织伊文氏蓝含量,评价肺微血管渗漏。（5）透射电镜观察肺气血屏障。（6）Western blot检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表达。（7）免疫组织化学观察肺组织紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表达。2.细胞水平（1）跨内皮细胞电阻测定。（2）测定HLMVECs对FITC-dextran的通透系数Pd。（3）透射电镜观察HLMVECs紧密连接超微结构。（4）ELISA检测HLMVECs上清中IL-6含量（5）Western blot检测HLMVECs紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表达。（6）Western blot检测HLMVECs p-ERK1/2、ERK1/2的表达。五、统计学分析用SPSS18.0统计软件处理数据,计量资料用`X±s表示。使用单因素方差分析（ANOVA）进行各组间比较,再用LSD法进行两两组间比较,p<0.05认为具有统计学差异。结果一、普通肝素对脓毒症大鼠急性肺损伤及紧密连接的影响1.动物模型的观察对照组术后饮食、精神状态、活动及反应良好,被毛较光滑。脓毒症组出现明显精神萎靡、反应迟缓,饮食、活动减少,呼吸频率增加,排粘液便,被毛竖起。脓毒症肝素治疗组术后较对照组略萎靡,饮食、活动及反应变慢,被毛不平滑,呼吸频率稍快,但精神、反应及活动状态好于脓毒症组。脓毒症组96小时生存率最低,脓毒症肝素治疗组生存率高于脓毒症组,对照组无动物死亡。2.肺组织病理学表现对照组肺泡开放,肺泡壁、肺泡隔形态清晰。脓毒症组肺泡部分塌陷或膨胀不良,肺泡壁及肺泡隔明显增宽,肺泡隔充血肿胀,内有大量炎症细胞浸润。脓毒症肝素治疗组肺泡隔肿胀增宽程度低于脓毒症组,炎症细胞浸润减少。3.支气管肺泡灌洗液中IL-6含量脓毒症组IL-6较对照组显著增加（27.76±4.10 vs.2.25±0.24,p<0.0001）,脓毒症肝素治疗组IL-6明显低于脓毒症组（12.50±1.65 vs.27.76±4.10,p<0.0001）,仍高于对照组（12.50±1.65 vs.2.25±0.24,p<0.0001）。4.肺湿干重比脓毒症组肺湿重增加,明显高于对照组（8.906±1.598 vs.4.319±0.100,p<0.0001）,脓毒症肝素治疗组湿重低于脓毒症组（5.389±0.444 vs.8.906±1.598,p<0.0001）,但仍高于对照组（5.389±0.444 vs.4.319±0.100,p<0.0001）。5.肺组织伊文氏蓝含量脓毒症组伊文氏蓝含量明显高于对照组（44.81±5.10 vs.11.29±2.82,p<0.0001）,脓毒症肝素治疗组低于脓毒症组（24.94±5.90 vs.44.81±5.10,p<0.0001）,但仍高于对照组（24.94±5.90 vs.11.29±2.82,p<0.0001）。6.肺组织气血屏障超微结构观察对照组大鼠气血屏障结构完整,肺泡上皮、毛细血管内皮细胞无肿胀或溶解破坏。脓毒症组肺泡上皮可见溶解破坏、边界不清晰,血管内皮细胞肿胀。脓毒症肝素治疗组肺泡上皮损伤及血管内皮细胞肿胀轻于脓毒症组。7.Western blot检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1表达脓毒症组claudin-5、occludin、ZO-1的表达明显均低于对照组,脓毒症肝素治疗组claudin-5、occludin、ZO-1表达较脓毒症组升高,但低于对照组,差异具有统计学意义（p<0.05）8.免疫组织化学检测肺组织紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达对照组claudin-5主要表达于肺泡隔毛细血管内皮细胞膜及胞浆边缘,occludin、ZO-1表达于肺泡上皮、肺泡隔毛细血管内皮细胞,其中occludin位于细胞膜及胞浆边缘,ZO-1位于靠近细胞膜的胞浆内,三者呈连续、波浪线状分布。脓毒症组claudin-5、occludin、ZO-1在肺组织表达均降低,分布失去连续性,仅有少量散在点、片状浅棕色染色。脓毒症肝素治疗组claudin-5、occludin、ZO-1表达高于脓毒症组,血管内皮或上皮细胞仍有部分呈连续、波浪状分布,阳性染色强于脓毒症组。二、普通肝素、U0126对HLMVECs FITC-dextran渗漏、紧密连接和ERK1/2 MAPK信号通路的作用1.LPS导致HLMVECs TEER降低LPS能导致HLMVECs TEER较基线降低,且随LPS作用时间的延长,下降更明显。LPS作用24小时,LPS5μg/ml组TEER低于对照组,但无明显差异（p>0.05）,LPS10、20、50、100μg/ml组TEER均明显低于对照组（p<0.05）。2.LPS导致HLMVECs紧密连接蛋白表达降低LPS5μg/ml能导致HLMVECs紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达明显降低（p<0.05）,但对claudin-5作用不明显（p>0.05）。LPS10、20、50μg/ml均能导致claudin-5、occludin、ZO-1表达明显降低（p<0.05）。3.普通肝素、U0126减轻LPS诱导的FITC-dextran渗漏LPS（10μg/ml）组对FITC-dextran的通透系数Pd值明显高于对照组（21.08±1.27 vs.10.89±1.87,p<0.0001）,LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组Pd值明显低于LPS（10μg/ml）组（14.22±2.24 vs.21.08±1.27,p<0.005）。LPS（10μg/ml）+U0126（25μM）组Pd值也明显低于LPS（10μg/ml）组（12.84±0.57 vs.21.08±1.27,p<0.005）。4.普通肝素减轻LPS导致的HLMVECs紧密连接超微结构损伤对照组内皮细胞间存在致密的、细线状紧密连接。LPS（10μg/ml）组内皮细胞胞浆与细胞膜交界处有大量空泡形成,细胞之间缝隙增大,紧密连接开放、断裂,结构不完整。LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组内皮细胞之间紧密连接结构未断裂,能封闭细胞间隙。5.普通肝素抑制LPS诱导的内皮细胞IL-6释放LPS（10μg/ml）组细胞上清中IL-6水平明显高于对照组（p<0.0001）,LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组IL-6水平显著低于LPS（10μg/ml）组（p<0.0001）。6.普通肝素减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接蛋白低表达LPS（10μg/ml）组claudin-5、occludin、ZO-1表达明显低于对照组（p<0.005）,LPS（10μg/ml）+肝素（10U/ml）组与LPS（10μg/ml）组比较,claudin-5、occludin、ZO-1的表达均有升高（p<0.05）。7.普通肝素抑制LPS诱导的HLMVECs ERK 1/2 MAPK磷酸化LPS10μg/ml能诱导HLMVECs p-ERK1/2 MAPK表达明显升高（p<0.0001）,用肝素10U/ml预处理能降低LPS导致的p-ERK1/2 MAPK高表达（p<0.05）。8.U0126减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1低表达LPS（10μg/ml）组claudin-5、occludin、ZO-1表达明显低于对照组（p<0.05）,LPS（10μg/ml）+U0126（25μM）组claudin-5、occludin、ZO-1的表达均较LPS（10μg/ml）组升高（p<0.05）结论1.普通肝素可能通过减轻肺组织炎症反应、上调紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达,减轻盲肠结扎穿孔术诱导的大鼠脓毒症急性肺损伤。2.普通肝素减轻LPS诱导的HLMVECs紧密连接超微结构破坏,减轻HLMVECs渗漏。3.普通肝素减轻HLMVECs渗漏可能与抑制LPS诱导的ERK1/2 MAPK活化、上调紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达有关。