系统研究特定信号转导通路网络及其动态变化过程是全面揭示该网络调控和作用机制的关键,也是目前组学研究的热点之一。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路具有调节生长、发育、分化和凋亡的重要功能,通过研究其中重要分子在信号转导过程中形成的蛋白质复合体的动态变化,有助于全面揭示该网络发挥调控功能的分子机制。串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)技术是近年发展起来的用于研究蛋白质复合体的新方法。TAP技术较其它纯化技术最大的优势在于可以分离接近生理条件的蛋白质复合体。借鉴国外在研究信号转导通路复合体方面的先进经验,我们拟采用TAP联合质谱技术(mass spectrometry,MS)开展丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路网络的相关研究。作为研究工作的基础,我们首先改建了TAP纯化系统。在本实验中我们引进了链霉亲和素结合肽(strptavidin binding protein,SBP)和钙调素结合肽(calmodulinbinding protein,CBP)作为TAP标签。SBP标签是一种新的链球菌抗生物素蛋白结合肽,由45个氨基酸组成,SBP标记的蛋白质可用固定化的链球菌抗生物素蛋白进行纯化,使用生物素进行洗脱,洗脱条件非常温和,无需使用烟草花叶病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶进行酶切,避免TEV蛋白酶酶切过程中对靶蛋白的影响,减少了大分子物质对蛋白复合体的污染。同时,SBP标签比ProtA标签更小,可有效降低TAP标签对诱饵蛋白折叠形成正确的二级结构的影响,避免因TAP标签的融合表达影响靶蛋白质复合体的形成。TAP技术适用于高等真核生物细胞蛋白质复合体的研究,是TAP技术较其它研究手段最大的优势。通过降低诱饵蛋白表达水平,使其接近体内真实的生理条件下,再对其相互作用蛋白质复合体进行分离纯化,能有效降低靶蛋白过表达造成结果的假阳性率,获得更为真实可信的复合体信息。在本实验中我们采用的降低诱饵蛋白表达水平的实验策略通常是筛选稳定表达TAP标签与诱饵蛋白的细胞系,这一策略相对而言更为稳定可靠。TAP技术的核心是借助标签蛋白质与特异亲和介质的亲和活性,经过串联进行的两次亲和过程,获得靶蛋白复合体。TAP标签的特殊结构决定了纯化流程的多步性,在保证分离特异性的同时,容易造成相互作用的破坏,相对剧烈的洗脱条件也可能破坏较弱的亲和,因此调整洗脱过程中多种缓冲液浓度、pH值和作用时间也是保证分离有效进行的技术关键。我们在前期进行了摸索性实验,并综合文献报道的实验方法,对TAP纯化的实验方案进行了优化,最终确定了实际操作的技术流程。经过TAP分离纯化后的蛋白质复合体,常用的实验策略是经SDS-PAGE进行分离。在本实验中,我们采用了更先进的差异蛋白分离和分析技术,即经双向差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)分离,DeCyder2D软件分析找到的差异点,再用Spot picker进行自动挖点进行后续的质谱鉴定。经过2D-DIGE分离和DeCyder 2D软件分析对照组和刺激组之间获得了35个差异蛋白点,其中34个蛋白刺激后结合增多,选取其中考染后清楚的14个蛋白点进行质谱鉴定。质谱鉴定和数据库搜索过程也是决定实验结果可靠性的关键步骤,本研究在质谱鉴定过程中严格设定质谱仪的工作参数和搜库标准,获得p38复合体的6个候选蛋白质数据信息,其中actin有文献报道与p38存在相互作用,这些关键数据反映了质谱鉴定结果具有一定的可信度。这些蛋白的发现为p38 MAPK信号转导通路的研究提供了多个功能线索和筛选分子。同时TAP-MS技术体系的成功建立,为开展丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路网络的蛋白复合体等规模化研究奠定了基础。总之,我们通过串联亲和纯化技术分离HEK293-pTAP-p38细胞中的p38蛋白复合体,使用2D-DIGE分析蛋白复合体并进行差异蛋白点的分析,挖取差异蛋白进行MALDI TOF/TOF质谱鉴定。通过研究,可以得出一下几点结论:1.通过G418筛选HEK293-pTAP-p38稳定表达细胞系,将TAP标记的p38基因整合到细胞系的基因组中有利于降低诱饵蛋白的表达量,减少了假阳性结合的蛋白,提高了纯化蛋白的可信度。2.优化TAP纯化条件,提高了蛋白复合体的纯化效率,有利于信号转导过程中低丰度蛋白的鉴定,这说明温和的结合条件和适当的反应体系有利于亲和结合。3.2D-DIGE分离蛋白复合体,通过软件分析得到35个差异蛋白,选取其中14个进行质谱鉴定,得到6个差异蛋白。4.根据文献报道以及前期实验室的研究表明actin与p38存在相互作用,其它蛋白的发现对p38的功能具有提示意义。