表观遗传是指基因的核苷酸序列不发生改变,而基因表达发生可遗传的变化的一种现象。表观遗传受多种蛋白的调控,这些表观遗传调控蛋白的异常会导致多种基因表达发生改变,从而可能引起包括自身免疫疾病、代谢疾病、神经失常和癌症在内的多种疾病的发生发展,因此,表观遗传调控蛋白已成为这些相关疾病的潜在治疗靶标。然而,相对于激酶、G蛋白偶联受体（GPCR）等,靶向表观遗传调控蛋白靶标的药物还非常少,对于大多数表观遗传调控蛋白,还缺乏小分子抑制剂。本人在攻读博士学位期间,主要针对两种表观遗传调控蛋白,即组蛋白去甲基化酶KDM4D和羟化酶JMJD6,开展了小分子抑制剂的设计和筛选,以及结构优化和生物活性研究。下面分别简述如下:第一部分组蛋白去甲基化酶KDM4D抑制剂的发现与生物活性研究KDM4D（又称JMJD2D）是一种包含Jmj C结构域的组蛋白去甲基化酶,属于KDM4（JMJD2）亚家族成员。其主要功能是在α-酮戊二酸（2-OG）参与下催化去除组蛋白H3K9上的甲基化修饰。KDM4D调控异常与肿瘤的发生、发展和耐药等密切相关,被认为是潜在的肿瘤治疗靶标。在本研究之前,尚未有KDM4D选择性抑制剂报导。为此,我们分别针对KDM4D的2-OG结合的催化位点和H3K9底物结合位点进行了小分子抑制剂的设计和筛选研究。1.1针对KDM4D催化位点的小分子抑制剂的发现与复合物晶体结构本部分研究中,我们首先采用基于分子对接的虚拟筛选以及子结构搜索方法,获得了两个苗头化合物,其中,化合物5-羟基-9-硝基吡唑并[1,5-a]喹唑啉-3-甲腈（2）的选择性较好。该化合物在10μM浓度下对KDM4D的抑制率为73.33%,显然其活性还有待提高。为此,我们针对化合物2进行了结构优化,共合成了32个全新结构的化合物,3个化合物显示了良好的KDM4D酶抑制活性,其中化合物5-羟基-2-甲基吡唑并[1,5-a]吡啶并[3,2-e]嘧啶-3-甲腈（21）的活性最好,其酶抑制活性(IC50)为0.41μM。然后,我们利用差式扫描荧光法（DSF）、等温滴定量热法（ITC）和微量热泳动（MST）等方法验证了该化合物的生物活性。选择性测试结果表明,化合物21对KDM2、KDM3、KDM5三个亚家族几乎没有抑制活性或活性很弱(IC50>10μM)。最后,为探索化合物21与KDM4D的相互作用模式,我们利用BL21（DE3）表达并纯化了人KDM4D蛋白,通过优化结晶条件,培养了化合物21与KDM4D复合物单晶,并解析了该晶体结构。结果表明,化合物21的吡啶环氮原子与KDM4D催化口袋中的Fe（II）形成配位键。化合物21的羟基与氨基酸LYS210和ASN202形成两个氢键。此外,化合物21的吡唑并嘧啶母核与活性位点中的两个芳香氨基酸PHE189和TRP212形成π-π相互作用力。该复合物晶体结构已上传至PDB数据库（PDB:7DYQ）。总之,在本部分的研究中我们发现了一个高活性、选择性的KDM4D小分子抑制剂化合物21。该化合物可作为靶向KDM4D的创新药物研发的先导化合物,值得进一步深入研究。1.2 KDM4D底物竞争性抑制剂的发现与生物活性研究在本部分研究中,我们首先基于计算机辅助药物设计,采用分子对接方法针对KDM4D组蛋白底物结合位点进行虚拟筛选,得到一个苗头化合物,即6-（吡啶-4-基（吡咯烷-1-基）甲基）苯并[d][1,3]二噁唑-5-醇（9）,其IC50值为1.751μM。随后我们对该化合物进行结构优化和构效关系分析,合成了约60个全新结构化合物,其中活性最好的化合物为叔-丁基（（3R）-1-（（6-羟基苯并[d][1,3]二噁唑-5-基）（4-（吡啶-4-基）苯基）甲基）吡咯烷-3-基）氨基甲酸酯（24s）,该化合物的IC50为0.023μM。进一步,我们通过ITC、DSF以及细胞热位移分析（CETSA）等方法验证了该化合物的与KDM4D的结合能力。动力学分析实验证明了化合物24s不是2-OG竞争性抑制剂。而分子对接的结果表明,24s与KDM4D的组蛋白底物结合口袋具有很好的相互作用。选择性测试结果显示,该化合物对其他测试的KDM家族成员（包括亚家族成员）具有超过1500倍的选择性。在细胞实验中,MTT和克隆形成的结果显示,化合物24s对结直肠癌细胞系HCT116、SW480和SW620具有良好的生存抑制活性和抗增殖活性。在划痕实验和Transwell迁移实验中,化合物24s能够显著抑制HCT116细胞的迁移能力。总之,在本部分研究中,我们发现了第一个在KDM4亚家族中具有选择性的小分子抑制剂。该化合物可作为化学探针应用于KDM4D生物学功能的研究。第二部分羟化酶JMJD6选择性小分子抑制剂的设计与生物活性研究JMJD6是一种Fe（II）和α-酮戊二酸依赖的氧化酶。早期的文献报导JMJD6是一种精氨酸去甲基化酶,但后来的研究表明它的生物学功能更偏向于赖氨酸羟化酶。JMJD6的调节异常和多种疾病的发生发展相关,尤其是癌症,包括结肠癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌、口腔癌和乳腺癌等。因此,JMJD6的小分子抑制剂被认为是潜在的肿瘤治疗药物。然而,到目前为止,只有极少的JMJD6小分子抑制剂被报导,且选择性均较差。为此,我们针对该靶点开展了小分子抑制剂的设计与筛选。我们首先基于计算机辅助药物设计,采用分子对接的方法对化合物库进行虚拟筛选,挑选出30个小分子进行酶水平的生物活性测试。由此获得三个苗头化合物,其中化合物2-（1H-吡唑-5-基）异烟酸（J2）,对JMJD6的抑制活性最好(IC50=1.99μM)。但该化合物对去甲基化酶家族蛋白（KDM3B,KDM4D,KDM5A）均表现出了一定的抑制活性,说明化合物J2对JMJD6的选择性仍有待提高。通过解析化合物J2与JMJD6同源蛋白KDM4D的共晶结构,以及叠合比对JMJD6与KDM3B/4D/5A活性位点内的关键氨基酸,我们设计、合成得到了选择性更好的化合物2-（1H-吡唑-5-基）异烟酸乙酯（1）,并对其进行结构优化,共合成了32个全新结构分子。其中对JMJD6抑制活性最好的为化合物为2,2,2-三氟乙基2-（1-甲基-1H-吡唑-3-基）异烟酸酯（7p）,该化合物的IC50值为0.681μM。DSF和CETSA实验进一步验证了化合物7p可与JMJD6蛋白结合。更重要的是,相比于其他α-酮戊二酸依赖的氧化酶,该化合物对JMJD6的选择性大于100倍。总之,我们发现了目前已报道的JMJD6小分子抑制剂中选择性最好的化合物7p,该化合物一方面可作为探针用于探索JMJD6的生物学功能,另一方面也可作为靶向JMJD6的药物先导化合物。综上所述,本人在攻读博士学位期间,利用计算机辅助药物分子设计、化学合成、活性测试、构效关系分析、以及结构生物学等方法和技术,针对组蛋白去甲基化酶KDM4D和羟化酶JMJD6,开展了小分子抑制剂的发现和生物活性研究,获得了多个具有全新结构的活性化合物。其中,针对KDM4D催化位点和底物结合位点,分别获得了国内外第一个高活性和选择性的小分子抑制剂,而针对JMJD6获得了目前已报道的JMJD6抑制剂中选择性最好的化合物7p。总之,本论文的研究为KDM4D和JMJD6的生物学功能研究提高了良好的小分子探针,同时也为靶向KDM4D和JMJD6的创新药物研发奠定了良好基础。