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哺乳动物的卵泡早期发育包括始基卵泡的形成和随后向初级卵泡、次级卵泡的转化,TGFβ信号通路在这一过程中发挥着重要的作用。该信号通路的激活是由TGFβ超家族的TGFβs配体分子与其受体结合,从而使受体磷酸化,磷酸化的受体再直接作用于SMAD蛋白,SMAD蛋白将配体和受体的作用信号传递到细胞核内,从而调控特定基因的表达。TGFβ1和TGFβRⅠ作为TGFβ信号通路的核心因子,在其信号转导中起着重要的作用,参与调节卵泡发育、卵母细胞和颗粒细胞以及颗粒细胞和卵泡腔细胞之间的双向信号转导。OSP1启动子是目前已知的能够在卵巢组织中高效表达的启动子,能够为研究外源基因在猪卵巢颗粒细胞中的作用提供可行的调控元件。因此,本研究针对TGFβ1和TGFβRⅠ基因对猪卵泡发育的作用,设计以下实验,具体研究内容如下:(1)采集梅山与杜洛克经产母猪各3头的卵泡样品,经q RT-PCR方法检测TGFβ/SMAD信号通路基因,THBS1、DCN、LTBP1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SKP1基因在梅山、杜洛克S、M1、M2、L卵泡中的表达量变化。结果表明:TGFβ/SMAD信号通路基因均在梅山与杜洛克的M2卵泡中存在表达差异,特别是LTBP1、TGFβ1及TGFβRⅠ基因在梅山猪各级卵泡中的表达量均极显著高于杜洛克(P<0.01),这提示TGFβ/SMAD基因可能参与卵泡发育过程。(2)根据已知大鼠OSP-1启动子序列扩增大鼠OSP-1片段,将其定向克隆到pc DNA3.1(+)中替代CMV启动子,并在其下游插入Zs GREEN基因片段,构建真核表达载体p OSP-1-Zs GREEN;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000的介导下转染不同细胞,在荧光显微镜下观察Zs GREEN表达情况,q RT-PCR方法检测该启动子在不同细胞中启动Zs GREEN基因表达的活性。结果显示:经克隆测序,得到了465bp OSP-1启动子序列,重组质粒转染卵巢颗粒细胞、Hela细胞可以观察到绿色荧光;q RT-PCR分析Zs GREEN基因在猪卵巢颗粒细胞、Hela细胞中高表达,在肌细胞中表达量极低,表明OSP-1启动子可驱动外源基因在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,为构建可用于猪卵巢颗粒细胞的表达载体提供了启动子。(3)根据Gen Bank中猪的TGFβRⅠ基因m RNA序列,针对基因编码区设计5对sh RNA干扰片段。以p PLL3.7作为载体骨架,通过替换其中CMV启动子,分别构建了p CMV-TGFβRⅠ-sh RNA及p OSP1-TGFβRⅠ-sh RNA干扰载体,通过脂质体LipofectamineTM2000转染猪卵巢颗粒细胞,分析TGFβRⅠ基因的相对表达量,检测p OSP1-TGFβRⅠ-sh5干扰载体及在细胞培养液中添加细胞生长因子TGFβ1处理对猪卵巢颗粒细胞的细胞增殖、细胞凋亡的影响。结果显示:经测序证实,5对合链的干扰片段和OSP1启动子插入位置符合预期,且上下游表达调控元件完整,表明p CMV-TGFβRⅠ-sh RNA及p OSP1-TGFβRⅠ-sh RNA干扰载体构建成功;q RT-PCR分析TGFβRⅠ基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达量,含有OSP1启动子的干扰载体干扰效率高于CMV启动子干扰载体,差异显著(P<0.05)。5个p OSP1-TGFβRⅠ-sh RNA干扰载体的干扰效率依次为64%、56%、61%、62%、78%,其中p OSP1-TGFβRⅠ-sh5对TGFβRⅠ基因的沉默效果最好;流式细胞仪检测p OSP1-TGFβRⅠ-sh5干扰载体及添加细胞生长因子TGFβ1处理对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响,干扰载体组细胞增殖率下降,差异极显著(P<0.01),添加TGFβ1细胞增殖率下降,差异显著(P<0.05);对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响,干扰载体组及添加TGFβ1细胞均会促进细胞凋亡,差异极显著(P<0.01)。(4)采用PCR-SSCP技术检测TGFβRⅠ基因和TGFβ1基因多态性,分析其与猪产活仔数之间的关联性。结果显示,TGFβRⅠ基因第7内含子第808位碱基存在A→G突变,在大白猪群体中检测出AA、AG、GG三种基因型,GG型母猪产活仔数比AA型多3.18个(P<0.01),比AG型多1.83个(P<0.05),长白猪群体中检测出AA、AG两种基因型,两种基因型母猪产活仔数之间无显著差异;TGFβ1基因在第7外显子上游的第9位碱基存在C→T突变,在大白及长白猪群体中均检测出CC、TT两种基因型,未检测出CT基因型,两种基因型母猪产活仔数之间无显著差异,表明TGFβRⅠ基因多态性与大白猪的产活仔数之间存在一定的关联性。本研究分析了TGFβ/SMAD信号通路基因在梅山和杜洛克经产母猪不同级别卵泡中的差异表达规律,TGFβRⅠ和TGFβ1基因对猪卵巢颗粒细胞的调控作用,及这两个基因多态性与猪产活仔数之间的关联性,为明确TGFβ/SMAD信号通路在卵泡发育过程中的作用,揭示TGFβRⅠ和TGFβ1基因对猪颗粒细胞生物学功能的影响,探讨猪种间排卵数差异的分子机理,进一步提高猪繁殖性能提供了重要的基础性依据。