论文部分内容阅读
研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,远处器官转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。骨是乳腺癌最常见的远处转移部位,但目前临床尚缺乏早期预测和有效治疗骨转移的方法。乳腺癌骨转移机制的研究将有助于发现早期预测骨转移风险和靶向治疗骨转移的新策略。叉头框转录因子F2（forkhead box F2,FOXF2）是调控组织细胞间质分化的关键转录因子。课题组前期通过体外细胞学实验研究,发现FOXF2在乳腺癌细胞中异位高表达可通过调控骨分化和骨重塑相关基因表达以及BMP/SMAD信号通路促进乳腺癌细胞的骨转移潜能。但是,FOXF2促进乳腺癌骨转移的作用以及BMP/SMAD信号通路介导FOXF2调控乳腺癌骨转移的分子机制尚无体内实验证据证实。研究目的本研究旨在通过临床病例研究和体内动物实验研究证实FOXF2调控乳腺癌骨转移的作用,并通过体内外实验证实BMP/SMAD信号通路介导FOXF2调控乳腺癌骨转移生物学进程的分子机制,从而为乳腺癌骨转移风险预测和早期诊断提供分子标志,为乳腺癌骨转移靶向治疗提供新策略。研究方法1.为了研究FOXF2表达水平与乳腺癌骨转移的关系,从公开发表的乳腺原发癌组织基因表达谱数据库中,筛选具有转移器官随访结果的队列GSE2034和GSE2603,将数据标准化后合并两个队列为GSE20342603。基于GSE20342603队列中乳腺原发癌组织FOXF2 mRNA水平和患者骨转移生存状态,利用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验,分析在所有病例（n=368）以及在Luminal（n=140）和三阴性（n=66）乳腺癌亚型中FOXF2 mRNA水平与骨转移生存状态的关系。2.为了研究FOXF2在乳腺癌骨转移中的作用,采用慢病毒感染和嘌呤霉素抗性筛选方法建立稳定过表达foxf2的小鼠乳腺癌细胞4T1-GFP-foxf2及其对照细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测Foxf2 mRNA和蛋白表达水平。将4T1-GFP-foxf2及其对照细胞接种于裸鼠脂肪垫,第30天处死小鼠。取原位瘤组织,游标卡尺测量肿瘤的最大径和最小径并计算肿瘤体积;取后肢骨,用PBS将骨髓腔内的细胞冲出,荧光显微镜下观察GFP阳性癌细胞克隆数和克隆大小;将后肢骨钼靶X线成像,观察溶骨性骨损伤;将骨组织固定24小时后用EDTA脱钙液脱钙两周,制备骨组织切片,通过H&E及TRAP染色观察骨转移状态和溶骨性病变;取肝和肺组织,置于4%甲醛中固定,解剖显微镜下计数肝和肺正反两面转移癌结节数量;石蜡包埋组织并制备组织切片,H&E染色确认肺转移和肝转移情况。3.为了研究FOXF2对乳腺癌细胞骨转移生物学行为的影响,采用慢病毒感染和嘌呤霉素抗性筛选方法建立稳定过表达FOXF2和沉默FOXF2表达的人乳腺癌细胞MDA-MB-231-GFP-FOXF2、MCF-7-GFP-FOXF2和MDA-MB-231-GFP-siFOXF2以及它们的对照细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测Foxf2mRNA和蛋白表达水平。通过异质细胞粘附,FOXF2过表达和沉默FOXF2表达的乳腺癌细胞向骨、肺和肝微环境的趋化能力,与骨、肺和肝微环境细胞的粘附能力,以及在骨、肺和肝微环境中的克隆形成能力。4.为了研究FOXF2调控乳腺癌细胞骨转移生物学行为的分子机制,采用Western blot检测MDA-MB-231-GFP-FOXF2、MCF-7-GFP-FOXF2和T-47D-GFP-FOXF2和MDA-MB-231-GFP-siFOXF2细胞以及它们的对照细胞中BMP和TGF-β信号通路效应分子SMAD1,p-SMAD1,SMAD2,p-SMAD2,SMAD3,p-SMAD3,SMAD4,SMAD6变化量。5.为了研究FOXF2对SMADs的转录调控作用,通过分析SMADs基因启动子区序列中FOXF2转录结合域,筛选FOXF2转录调节的候选靶基因;通过ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验验证FOXF2与候选靶基因的结合及对候选靶基因的转录活性的调节。6.为了证实BMP/SMAD对FOXF2调控乳腺癌细胞骨转移的介导作用,将MDA-MB-231-GFP-FOXF2细胞和对照组细胞经左心室注射于裸小鼠体内,将4T1-GFP-Foxf2细胞和对照组细胞接种于裸小鼠脂肪垫,注射MDA-MB-231-GFP-FOXF2细胞和接种4T1-GFP-Foxf2的实验组小鼠各分为两组,其中一组小鼠每周注射三次腹腔注射BMP/SMAD信号通路抑制剂Noggin7.（100μg）。经心室注射乳腺癌细胞的小鼠于注射细胞后第50天之后进行小鼠活体成像观察骨转移,钼靶X线照射成像观察溶骨性损伤;所有小鼠处死（心室接种第50天,原位接种第30天）后取后肢骨、肺和肝组织,经4%甲醛固定,石蜡包埋制备组织切片,H&E和TRAP染色统计分析骨、肺和肝转移。结果1.临床病例研究显示在所有病例以及在Luminal和三阴性乳腺癌亚型中,FOXF2 mRNA高表达组患者的无骨转移生存时间均显著低于FOXF2 mRNA低表达组。提示FOXF2高表达与乳腺癌患者骨转移发生风险相关,且无亚型特异性;乳腺原发癌组织中FOXF2 mRNA水平可预测患者骨转移风险。2.动物实验显示过表达Foxf2的Basal-like亚型4T1细胞的成瘤体积较对照细胞显著增加,原位瘤组织的血管数量显著减少,在骨髓中形成的克隆数和克隆直径显著增加,溶骨性骨损伤显著增强,癌细胞骨转移增加,但肺转移和肝转移显著减少,提示FOXF2高表达促进乳腺癌细胞骨特异性转移。3.体外细胞学实验显示过表达FOXF2的Basal-like亚型细胞MDA-MB-231细胞与MG-63细胞的异质粘附能力增强,与BEAS-2B细胞的粘附能力降低;沉默FOXF2的MDA-MB-231细胞与MG-63细胞的异质粘附能力降低,与BEAS-2B细胞的粘附能力增加。异位表达FOXF2的Luminal亚型细胞MCF-7与MG-63细胞的异质粘附能力增强,而与BEAS-2B细胞的粘附能力无显著改变,提示FOXF2促进Basal-like亚型细胞的骨转移潜能但抑制肺转移潜能,FOXF2异位高表达促进Luminal亚型细胞骨转移潜能。4.在基底样亚型细胞MDA-MB-231中过表达FOXF2以及Luminal亚型细胞MCF-7和T47D中异位表达FOXF2均可上调SMAD1和p-SMAD1蛋白表达水平,下调p-SMAD2与p-SMAD3蛋白表达水平,SMAD2、SMAD3、SMAD4和SMAD6蛋白无显著变化,提示FOXF2可通过上调SMAD1表达激活BMP/SMAD信号通路,同时抑制TGF-β/SMAD信号通路。5.SMADs基因的启动子序列分析显示,SMAD1启动子–322/–315区域为FOXF2的经典转录结合位点;ChIP实验证实在MDA-MB-231和MCF-7细胞中FOXF2均可与含–322/–315位点的SMAD1启动子区结合;双荧光素酶报告基因实验证实在MCF-7细胞中过表达FOXF2增强SMAD1的转绿活性,在MDA-MB-231细胞中沉默FOXF2表达抑制SMAD1的转录活性。基于GSE20342603队列的数据分析显示在发生单纯骨转移的乳腺原发癌组织中SMAD1 mRNA水平显著高于发生非骨转移乳腺原发癌组织;FOXF2 mRNA与SMDA1 mRNA水平联合分析显示FOXF2high/SMAD1high患者发生骨转移风险显著高于FOXF2high/SMAD1low、FOXF2low/SMAD1high、FOXF2low/SMAD1low患者,提示SMAD1是FOXF2的直接转录调控靶基因,FOXF2-SMAD1转录调控轴激活显著促进乳腺癌骨转移,FOXF2 mRNA与SMDA1 mRNA水平联合可预测乳腺癌患者发生骨转移风险。6.动物实验显示BMP/SMAD信号通路抑制剂Noggin可显著抑制过表达FOXF2的MDA-MB-231细胞和4T1细胞导致的溶骨性骨损伤和骨转移,但对抑制的肺转移和肝转移无显著影响,提示BMP/SMAD信号通路介导FOXF2调控的乳腺癌细胞骨特异性转移。结论1.FOXF2促进乳腺癌细胞骨转移但抑制基底样乳腺癌细胞内脏转移;2.SMAD1是FOXF2的直接转录调控靶基因,FOXF2-SMAD1转录调控轴激活促进乳腺癌骨转移;3.抑制BMP/SMAD信号通路可显著抑制FOXF2调控的骨转移;4.FOXF2 mRNA水平及其与SMDA1 mRNA水平联合可预测乳腺癌患者发生骨转移风险。