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研究背景重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是以波动性和非正常的肌肉疲劳为特征的一类自身免疫性疾病。自身抗体通过B细胞介导、T细胞依赖、补体参与从而破坏神经肌肉接头。自身抗体主要包括抗乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor,ACh R)(85%病人)抗体、抗肌肉特异性激酶(Muscle-Specific Kinase,Musk)抗体和抗脂蛋白相关蛋白4(Lipoprotein-Related Protein 4,LRP4)抗体。抗乙酰胆碱受体抗体阳性型MG主要是乙酰胆碱受体的α1亚基的胞外域受到攻击。树突状细胞(Dendtric cells,DCs)是目前发现功能最强的体内抗原递呈细胞(Antigen-presenting cells,APC),其最大的特点就是表型和功能的灵活性。DCs吞噬、消化、呈递外周抗原给外周器官淋巴结区的T细胞,激活共刺激分子CD40、CD80、CD86等引起免疫反应。而未活化的DC,即未成熟树突状细胞(Immature dendritic cell,i DC)可以诱导产生调节性T细胞(Regulatory T cell,treg)或T细胞无能等,导致抗原外周免疫耐受。DEC205是一种C型凝集素受体,在T细胞淋巴结区的DC上特异性表达。目前,基于i DC诱导免疫耐受的方法已用于各类自身免疫性疾病的预防和治疗。在以细胞免疫为主的自身免疫性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性甲状腺炎和非肥胖性糖尿病动物模型中,负载抗原或免疫优势肽段的未成熟髓源DC能有效预防抗原诱导的免疫反应。目的利用R97-116多肽免疫,建立实验性自身免疫性重症肌无力(Experiment autoimmune myasthenia gravis,EAMG)小鼠模型,并进行评估;体外表达和纯化sc Fv205和ACh Rα1 97-116蛋白,以及二者融合蛋白ACh Rα1-sc Fv205,并进一步分析ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白与DC的结合能力和生物学活性。最后研究ACh Rα1-sc Fv205对EAMG模型发病状况的影响,并探讨其中相关分子机制。方法1.利用R97-116多肽混合弗氏佐剂免疫小鼠,经三次免疫后观察其症状和体征,测定抗R97-116和抗ACh Rα1亚基抗体浓度,评价EAMG建模效果。2.构建和表达融合单链抗体ACh Rα1-sc Fv205以及非融合的sc Fv205和ACh Rα197-116片段。体外培养小鼠骨髓源性的i DC,利用显微镜和扫描电镜观察其形态变化,流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测其表面共刺激分子和特异性标志分子,分析i DC的免疫表型;流式和免疫荧光检测ACh Rα1-sc Fv205与DC的亲和力。分别在融合单链抗体给予小鼠的第1、21d,MACS分选脾CD11C+DC以及R97-116特异性的CD4+T细胞,MTT法检测ACh Rα1-sc Fv205对R97-116特异性CD4+T细胞增殖活性的影响。3.利用EAMG小鼠模型确定ACh Rα1-sc Fv205是否可以预防EAMG发病。FCM检测调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)的比例变化和DC表型。ELISA检测DC分泌IL-10及TGF-β的水平,以及小鼠血清中抗小鼠Ach Rα1亚基抗体浓度。结果1.通过每一月一次皮下注射R97-116及弗氏佐剂,3个月后,发现50%的小鼠出现震颤、弓背、肌力下降、体重降低等肌无力症状,ELISA结果显示,小鼠血清中存在较高浓度的抗R97-116和抗ACh Rα1亚基抗体,表明成功建立了EAMG小鼠模型。2.分别构建sc Fv205和ACh Rα1 97-116,以及ACh Rα1-sc Fv205融合表达的质粒,转染大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western-bolt结果显示:相对应的大小位置处有目的条带。采用Ni2+-NTA柱,成功分离纯化了sc Fv205、ACh Rα1 97-116大小位置处和ACh Rα1-sc Fv205大小位置处融合蛋白,初步测定纯度为75%。分离小鼠骨髓细胞,经诱导培养,细胞的形态符合DC特征,且经LPS诱导后共刺激分子CD40、CD80、CD86表达水平增加。通过流式细胞术检测发现,ACh Rα1-sc Fv205、sc Fv205及ACh Rα1 97-116对i DC的亲和力分别为41.4%、43.2%和7.0%,表明sc Fv205与DC之间具有特异性的结合能力。进一步研究结果显示,ACh Rα1-sc Fv205可以特异性的结合到脾脏中CD11C+细胞。分离融合单链抗体给予小鼠24h后脾脏的DC,发现ACh Rα1-sc Fv205可以靶向结合到DC,并刺激R97-116特异性CD4+T细胞增殖。分离融合单链抗体给予小鼠21天后脾脏的DC,发现ACh Rα1-sc Fv205并不能刺激R97-116特异性CD4+T细胞增殖。这些结果说明:ACh Rα1-sc Fv205能够特异性结合DC细胞,并诱导相关的免疫耐受反应。3.在EAMG小鼠模型中,预防性给予ACh Rα1-sc Fv205,能够明显降低EAMG发病率。进一步分析结果显示,给予ACh Rα1-sc Fv205的小鼠体内ACh Rα1亚基抗体浓度明显低于单独给予ACh Rα1 97-116和sc Fv205(P<0.05)。此外,ACh Rα1-sc Fv205能够维持DC未成熟表型,增加小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例,促进DC分泌IL-10和TGF-β。结论成功构建了EAMG小鼠动物模型,并获得了ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白,研究结果显示ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白能够特异性地结合到体内脾脏DC,并维持其未成熟表型,刺激产生IL-10、TGF-β等抑制性免疫因子,诱导产生Treg细胞,降低体内自身抗体。体内外实验显示ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白能够抑制EAMG发生。