超低温冻存技术能够实现细胞的长期稳定保存,是细胞治疗、辅助生殖等再生医学疗法中的重要技术支撑。然而,目前最常见的冻存保护剂二甲基亚砜（DMSO）可能造成细胞结构和功能的不可逆损伤,且与临床患者在细胞移植后出现的不良反应密切相关,因此亟需开发一种不含DMSO的细胞冻存保护剂。羟乙基淀粉（Hydroxyethyl starch,HES）是一种可生物降解的支链淀粉衍生物,具有良好的抗冻性能、膜稳定作用以及抑制渗透损伤的能力,但无法入胞的性质使得其单组分冻存保护效率有限。广泛存在于自然界生物中的天然渗透型组分,生物相容性好,具有调节细胞内外渗透压平衡及抑制氧化损伤的作用。因此,基于细胞冻存损伤机制,本文选用临床安全可用的HES作为细胞外冻存保护剂,以天然渗透型组分脯氨酸作为细胞内冻存保护剂与HES联用,实现冻存细胞内、外的协同保护作用,从而提高冻存保护效率,以达到临床治疗用细胞的冻存要求。本文的主要研究内容如下:（1）淀粉基细胞冻存保护剂的配方筛选。以永生化人角质形成细胞为模型,细胞毒性实验证实HES具有显著优于DMSO的生物相容性。考察两种分子量HES的细胞冻存保护效果,优选出HES 130/0.4作为细胞外冻存保护剂,但其单独使用时无法达到与DMSO相当的冻存保护效率。初步筛选四种渗透型组分（脯氨酸、左旋肉碱、甜菜碱、依克多因）,进一步考察HES与各渗透型组分联用后的细胞冻存保护效果,结果表明HES与脯氨酸联用后的保护效果显著优于HES单组分及其他复配组,故最终确定淀粉基细胞冻存保护剂配方为HES与脯氨酸的组合。（2）淀粉基细胞冻存保护剂的配方优化。以人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）为模型,细胞毒性实验证实HES、脯氨酸的生物相容性均显著优于DMSO。通过响应面法优化冻存保护剂配方,并进一步验证复苏后细胞的功能,确定淀粉基细胞冻存保护剂的最终配方为:12.5%HES+4.2%脯氨酸,冻存前与细胞共孵育50 min。在该条件下冻存的细胞,其复苏活率（90.35±0.68%）、贴壁能力、增殖能力均与DMSO冻存组细胞相当。（3）淀粉基细胞冻存保护剂的冻存保护特性研究。结果表明,所构建的淀粉基细胞冻存保护剂能够降低溶液冰点及成核温度,增加溶液中未冻结水含量,抑制冰晶形成和生长,从而减轻细胞冻存过程中的冰晶损伤;能够在高渗条件下维持细胞活性及正常形态,缓解渗透损伤;能够在氧化应激环境中,提高细胞SOD活力、降低MDA含量,减少活性氧的产生,减轻氧化损伤。（4）淀粉基细胞冻存保护剂的hUC-MSCs冻存保护效果评价。使用所构建的淀粉基细胞冻存保护剂冻存hUC-MSCs,复苏后的细胞形态与新鲜细胞无异;细胞贴壁能力、增殖能力、细胞迁移能力、细胞凋亡水平均与传统冻存保护剂DMSO冻存组相当;细胞活性氧水平显著低于DMSO组,线粒体膜电位显著高于DMSO组,表明该淀粉基细胞冻存保护剂具有更强的氧化损伤抑制作用;细胞表面蛋白标志物的表达和细胞分化潜能与新鲜细胞一致;细胞相关蛋白的表达较DMSO组更接近于新鲜细胞的表达水平,表明该淀粉基细胞冻存保护剂能保持hUC-MSCs的正常生物学功能。综上所述,本文通过将HES与脯氨酸复配,构建了一种具有较好生物相容性和冻存保护效果的淀粉基细胞冻存保护剂,可以替代DMSO冻存保护剂,为临床治疗用细胞的冻存方法提供了新参考。