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目的:通过未成熟小鼠和去卵巢小鼠的动物模型研究丹参的雌激素样作用及其作用机制,进一步探讨藜芦配伍丹参后,对丹参雌激素样作用的影响,为中药十八反“诸参辛芍叛藜芦”中“藜芦反丹参”的配伍禁忌内涵提供实验依据。方法:采用未成熟小鼠和去卵巢小鼠的动物模型研究丹参的雌激素样作用及其作用机制,并探讨藜芦配伍丹参后对其雌激素样作用的影响。1.未成熟小鼠模型:出生21天,体重9-12g,昆明种雌性刚断乳小鼠,按小鼠体重均衡原则和随机的原则将其分为:空白组(Con)、阳性给药组(E2)、阳性药+雌激素受体拮抗剂ICI组(E2+ICI)、阳性药+藜芦组(E2+ VN)、丹参低剂量组(SM1.6g/kg)、丹参低剂量+雌激素受体拮抗剂ICI组(SM1.6 g/kg + ICI)、丹参低剂量+藜芦组(SM1.6 g/kg + VN)、丹参高剂量组(SM3.2g/kg)、丹参高剂量+雌激素受体拮抗剂ICI组(SM3.2 g/kg + ICI)、丹参高剂量+藜芦组(SM3.2 g/kg + VN),每天灌胃给药一次,连续7d,每天同一时间点制作小鼠阴道涂片观察动情周期。小鼠最后一次给药后24h,称重记录,摘除眼球取血,用4℃离心机3000rpm离心15min,分离血清并分装于EP管中,采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测血清中雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)和促卵泡生成素(FSH)的含量水平。摘除眼球后小鼠进行脱颈椎处死,摘取子宫、阴道和肾上腺,称重记录并计算子宫系数和肾上腺系数;将子宫左侧角和阴道宫颈近端部分放于固定液(4%的多聚甲醛)中固定,一部分用于HE染色,观察子宫和阴道的病理形态学变化一部分用于免疫组织化学检测,观察靶器官子宫和阴道雌激素受体ER α和ER β蛋白的分布情况。子宫右侧角和阴道宫颈远端部分立即放于-80℃冷藏,一部分用于Western blot实验,检测靶器官子宫和阴道雌激素受体ERα和ERβ蛋白的表达情况,一部分用于Realtime PCR实验,检测靶器官子宫和阴道雌激素受体ER α和ER β mRNA的表达情况。2.去卵巢小鼠模型:2月龄,体重20-25g,昆明种雌性未孕小鼠,切除两侧卵巢,假手术组不切除双侧卵巢,只切除卵巢周围相同大小的脂肪。按小鼠体重均衡原则和随机的原则将其分为:假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)、阳性对照组(E2)、阳性药+雌激素受体拮抗剂组(E2+ICI)、阳性药+藜芦组(E2+VN)、丹参低剂量组(SM1.6g/kg)、丹参低剂量+雌激素受体拮抗剂组(SM1.6 g/kg + ICI)、丹参低剂量+藜芦组(SM1.6 g/kg + VN)、丹参高剂量组(SM3.2g/kg)、丹参高剂量+雌激素受体拮抗剂组(SM3.2 g/kg + ICI)、丹参高剂量+藜芦组(SM3.2 g/kg + VN),其中,藜芦给药剂量为0.β45g/kg/d。除了雌激素受体拮抗剂ICI组为腹腔注射5mg/kg/d,其余各组每天灌胃给药一次,给药持续4周。小鼠最后一次给药后24h,称重记录,摘除眼球取血,用4℃离心机3000rpm离心15min,分离血清并分装于EP管中,采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测血清中雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)和促卵泡生成素(FSH)的含量水平。摘除眼球后小鼠进行脱颈椎处死,摘取子宫、阴道和肾上腺,称重记录并计算子宫系数和肾上腺系数;将子宫左侧角和阴道宫颈近端部分放于固定液(4%的多聚甲醛)中固定,一部分用于HE染色,观察子宫和阴道的病理形态学变化一部分用于免疫组织化学检测,观察靶器官子宫和阴道雌激素受体ER α和ERβ蛋白的分布情况。子宫右侧角和阴道宫颈远端部分立即放于-80℃冷藏,一部分用于Western blot实验,检测靶器官子宫和阴道雌激素受体ERα和ERβ蛋白的表达情况,一部分用于Realtime PCR实验,检测靶器官子宫和阴道雌激素受体ERα和ERβ mRNA的表达情况。3.人乳腺癌MCF-7细胞模型:采用MTT法检测丹参、丹参配伍藜芦对雌激素受体阳性表达的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖作用。实验开始前3d改用无酚红DMEM(含5%活性炭过滤胎牛血清)的培养条件下培养,以耗尽细胞内源性雌激素。选择对数生长期细胞,用无酚红DMEM以5000个/孔的浓度接种于96孔板内,180μL/孔。待细胞贴壁后,给药干预培养48h后,加入MTT染色后于490nm条件下测定吸光度并计算细胞增值率。其中,给药浓度分别为丹参(SM)0.0001mg/mL～1mg/mL、丹参配伍藜芦各浓度组、10-9 M雌二醇组、10-8 M ICI 182,780组及空白组。4.采用ERs binding试剂盒观察藜芦对丹参雌激素受体结合能力的影响,按照说明书配制相应溶液后加入384孔黑板,混匀后避光室温孵育2h,于波长485/535nm检测。成果:1.丹参具有雌激素样作用实验研究表明,给予1.6g/kg-3.2g/kg的丹参时,对雌激素水平相对较低的未成熟小鼠和去卵巢小鼠具有雌激素样作用。丹参能使未成熟小鼠提早出现动情期,恢复去卵巢小鼠的动情周期;促进未成熟小鼠生殖靶器官子宫、阴道的生长发育,拮抗去卵巢小鼠子宫、阴道的萎缩;同时抑制由去卵巢造成的小鼠体重增加的增长。2.丹参通过提高雌激素样的含量水平和雌激素受体ERs的表达量发挥雌激素样作用实验研究表明,丹参雌激素样作用的发挥是通过提高血液中雌激素的含量水平和上调雌激素受体的表达量。丹参可提高未成熟小鼠和去卵巢小鼠血液循环中雌二醇E2的含量,降低黄体生成素LH和促卵泡激素FSH的含量;上调生殖靶器官子宫、阴道组织中雌激素受体ER α和ERβ的蛋白和基因的表达。3.藜芦配伍丹参后干扰丹参的雌激素样作用实验研究表明,丹参藜芦合煎液可干扰丹参对未成熟小鼠和去卵巢小鼠的雌激素样作用。与单用丹参高、低剂量相比,0.045g/kg/d的藜芦配伍丹参,藜芦能明显抑制丹参促进未成熟小鼠和去卵巢小鼠的子宫增重的作用,且无动情迹象出现;同时,丹参促进未成熟小鼠生殖靶器官子宫、阴道生长发育作用和拮抗去卵巢小鼠子宫、阴道萎缩作用减弱。体外实验研究发现,0.001mg/mL～1mg/mL的藜芦与0.OO1mg/mL～1mg/mL的丹参配伍给药,藜芦干扰丹参促人乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用。4.藜芦通过下调雌激素的含量水平和雌激素受体ERs的表达量来干扰丹参的雌激素样作用实验研究发现,与单用丹参高、低剂量比较,0.045g/kg/d的藜芦配伍丹参组中雌激素的含量水平降低,雌激素受体ERs的表达量下降,作用与雌激素受体拮抗剂ICI类似,提示藜芦具有雌激素受体拮抗剂样作用,是通过降低血液中雌激素的含量水平和雌激素受体ERs的表达量来干扰丹参的雌激素样作用。ERs binding试剂盒结果表明,藜芦干扰丹参增加雌激素受体亲和力的作用。结论:丹参具有雌激素样作用,藜芦可以妨害丹参的雌激素样作用,其机制是藜芦干扰丹参提高血液中雌激素含量和增加靶器官雌激素受体表达的作用,该研究为丹参和藜芦这一反药配伍组合的禁忌内涵提供科学实验证据。