子宫内膜癌(endometrial carcinoma或carcinoma of endometrium,EC)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见。为女性生殖道三大恶性肿瘤之一,占女性全身恶性肿瘤的7%。在全世界范围不同地区其发病率有差异,北美、北欧地区发病率最高,亚洲日本、印度及中南美等地区发病率较低。我国尚缺乏比较详尽的子宫内膜癌流行病学调查资料,估计与日本发病情况相仿。近年来子宫内膜癌的发病率有上升趋势。至今,子宫内膜癌的病因尚不十分清楚。已知子宫内膜的生长及功能主要受雌、孕激素的调控,子宫内膜癌的发生与高水平的雌激素状态有关。孕激素通常是在雌激素作用的基础上发挥效应的。内源性或外源性雌激素的长期刺激是子宫内膜癌最重要和直接的原因。雌激素可以刺激子宫内膜过度增生进而致不典型增生,并最终发展为内膜癌。30年前,Bohkman根据子宫内膜癌的临床及病理特点提出了子宫内膜癌二元模型,即Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型为雌激素依赖型(estrogen-dependent),其可能是在无孕激素拮抗的雌激素长期作用下发生子宫内膜增生症,继而癌变。这种类型占子宫内膜癌的大多数,均为子宫内膜样腺癌,肿瘤分化较好,雌激素受体(estrogen receptor, ER)阳性率高,预后好。Ⅱ型是非雌激素依赖型(estrogen-independent),发病与雌激素无明确关系。在癌灶周围可以是萎缩的子宫内膜,肿瘤恶性度高,分化差,雌激素受体多呈阴性,预后不良。成熟微小RNA(microRNA, miRNA)是一类由20-23个核苷酸组成的内源性非编码单链小RNA,通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)互补结合导致靶基因的降解或抑制靶基因的翻译,在转录后水平调节基因的表达。miRNA在蠕虫、苍蝇、鱼、鼠和人类细胞的各种生物进程中起着重要作用,与细胞增殖、分化、凋亡、生长发育和新陈代谢等密切相关,其表达水平随着生理状态和细胞发育水平动态变化。人类编码蛋白基因的30%以上受miRNAs调节。自1993年Lee等在秀丽线虫中发现首个miRNA,lin-4以来,miRNAs日渐成为肿瘤学领域研究的热点之一,表达失调的miRNA可通过其癌基因或抑癌基因的作用导致肿瘤的发生。ER和孕激素受体(progesterone receptor, PR)广泛存在于女性生殖器官的组织细胞中,是接受雌、孕激素统一调节的物质基础。研究显示,雌二醇能够抑制或激活miRNA的表达,miRNA可能通过抑制调节因子的表达而调节ER的活性,从而影响雌二醇或其他雌激素的代谢,因而异常表达的miRNA可能与雌激素相关的乳腺癌和子宫内膜癌的发生发展有关。Has-miR-181(miR-181)是miRNAs大家族中的一员。研究发现miR-181在啮齿类动物的造血祖细胞中异常过表达,用不同条件处理细胞后发现B淋巴细胞数量加倍,而T淋巴细胞不受影响,提示了miR-181可能在鼠和人的细胞发育分化中起着关键的作用。miR-181家族包括miR-18a、miR-181b、miR-181c和miR-181d。miR-181a在细胞的增殖、发育和分化过程中起着重要的调控作用,其表达异常是导致细胞功能异常的原因所在。在许多肿瘤中miR-181a表达失调,如白血病、乳腺癌、肝癌、结直肠癌和神经胶质细胞瘤等。另外miR-181a能够调节Bcl-2、TGF-β、PTEN、ATM等与肿瘤增生,分化,转移相关因子的表达。总之,miR-181a在肿瘤的发生发展中起着及其重要的作用。目前,国内尚未见关于子宫内膜癌与miR-181a的研究报导,国外也仅见零星报道。国外有学者利用新鲜冰冻组织进行实验,结果表明miR-181a在子宫内膜癌中的表达上调,并认为其靶基因可能为PR,过表达的miR-181a通过抑制靶基因PR的表达进而参与子宫内膜癌的发生发展。目前对miRNAs的研究大多是基于新鲜冰冻组织、细胞或血清,但新鲜冰冻组织的长期贮存困难又昂贵。相反,甲醛固定石蜡包埋组织资源丰富,贮存简单方便,易于获取,亦可用于疾病生物标志物及发生的分子机制的研究。然而国内外很少有实验利用甲醛固定石蜡包埋组织进行miRNAs的相关研究。那么利用甲醛固定石蜡包埋组织是否可以检测到miRNA表达呢?miR-181a在子宫内膜癌组织中的表达是否与种族、地域有关?miR-181a是否与Ⅰ型和Ⅱ型内膜癌的起源有关呢?能否把miR-181a作为诊断分型、治疗和判断临床预后的切入点?这都是比较令人感兴趣的问题。基于此,本课题以甲醛固定石蜡包埋组织为材料,利用实时荧光定量PCR技术检测子宫内膜组织中miR-181a的表达。第一章旨在检测甲醛固定石蜡包埋组织标本中,正常子宫内膜、子宫内膜增生症、子宫内膜癌组织中miR-181a的表达,探讨miR-181a在子宫内膜癌变过程中的表达及其临床意义。第二章是在第一章的基础上,根据免疫组化检测结果将子宫内膜癌组分为Ⅰ型和Ⅱ型,比较不同类型子宫内膜癌组织中miR-181a的表达情况,分析miR-181a是否与不同类型内膜癌起源有关。第一章探讨miR-181a在子宫内膜癌变过程中的表达及其临床意义一研究内容与方法探讨miR-181a在子宫内膜癌变过程中的表达及其临床意义。选择2011年1月～2013年12月,南方医科大学附属小榄医院收治的72例患者及中山大学附属中山医院收治的4例、南方医院收治的2例Ⅱ型子宫内膜癌患者。所有标本均为甲醛固定石蜡包埋子宫内膜组织。患者年龄24～69岁,平均48岁。其中,子宫内膜癌47例,子宫内膜增生症18例,正常子宫内膜13例,术前均未行放疗、化疗及内分泌治疗,术后诊断均经病理证实。每例石蜡标本连续切片,切10张,每张厚101μm,同时取组织细胞含量在50%以上区域的切片每例2～5张(平均4张),脱蜡,提取总RNA。采用hsa-miR-181a SYBR green实时荧光定量PCR方法检测各例子宫内膜组织中miR-181a的表达。miRNA表达水平采用相对定量方法,即计算△Ct=Ct(miR-181a)-CtU6来表示相对表达量,计算AACt=(Ct(miR-181a)-Ctu6)实验组-(Ct(miR-181a)-CtU6)对照组,以2-ΔΔct表示miRNA的变化倍数。二结果1甲醛固定石蜡包埋组织中可以检测到miR-181a表达。2miR-181a在子宫内膜癌组织、子宫内膜增生组织中的表达较正常子宫内膜组织分别上调11.228、4.073倍。子宫内膜癌组织中miR-181a表达较增生组织上调2.757倍,各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。3miR-181a的表达与FIGO分期有关,差异有统计学意义(P<0.05)。三小结MiR-181a在子宫内膜癌组织中表达上调,可能起到了癌基因的作用；miR-181a在子宫内膜癌变过程中的差异表达可能与子宫内膜癌的发生、发展有关,其有可能成为子宫内膜癌早期诊断及预后评估的一种新型生物标志物。在甲醛固定石蜡包埋组织中可以检测到miR-181a的表达,可以用石蜡包埋组织进行miR-181a相关方面的研究。第二章Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a的表达及其意义一研究内容与方法将第一部分中子宫内膜癌石蜡标本进行免疫组化染色实验,检测其中雌激素受体ER、PR表达,染色(一)为阴性表达,染色(+)～(+++)均为阳性表达。根据结果分雌激素依赖型即Ⅰ型子宫内膜癌(ER+、PR+)和非雌激素依赖型即Ⅱ型子宫内膜癌(ER-、PR-)。统计分析Ⅰ型和Ⅱ型内膜癌中miR-181a差异表达。二结果1miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中表达较正常子宫内膜组织分别上调8.515倍、31.233倍(P<0.05)。2miR-181a在Ⅱ型内膜癌组织中的表达高于Ⅰ型内膜癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。3Ⅱ型内膜癌组织中miR-181a的表达较子宫内膜增生组织明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。三小结MiR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌间的差异表达可能与不同类型子宫内膜癌的发生发展有关,且其可能与Ⅱ型子宫内膜癌的发病机制有关,可为进一步研究子宫内膜癌发生的分子机制提供依据。全文结论1在甲醛固定石蜡包埋子宫内膜组织中可以检测到miR-181a的表达,可以利用甲醛固定石蜡包埋组织进行miRNAs相关方面的研究。甲醛固定石蜡包埋组织资源丰富,贮存简单方便,易于获取,而新鲜冰冻组织储存昂贵又困难,因此,今后可以加大石蜡包埋组织的利用。2miR-181a在子宫内膜癌组织中表达上调,可能起到了癌基因的作用；且从正常子宫内膜组织,子宫内膜增生组织,到子宫内膜癌组织,miR-181a表达逐渐上升,提示miR-181a可能与子宫内膜癌的发生的早期事件,其有可能成为子宫内膜癌早期诊断及预后评估的一种新型生物标志物。3miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中表达明显高于正常子宫内膜组织,且miR-181a在Ⅱ型内膜癌组织中的表达较Ⅰ型内膜癌组织明显上调。因此我们认为,miR-181a表达差异可能与不同类型子宫内膜癌的发生、发展相关,可能是引起两种内膜癌分型生物学特性不一样的内在分子机制。