病原诱导启动子和组织特异性启动子的分离克隆和功能鉴定

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:danshenguizu920
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基因的表达和调控是生物体内十分重要的机制之一,它是生物体代谢、发育、生殖等一系列生理活动的根本所在。基因的特异性表达决定了生物体的特异性,一直以来都是研究的热点。启动子是直接调控基因特异性表达的重要元件,它驱动基因的表达,决定了基因表达的强度、时间和空间等特异性。水稻中的OsWRKY13基因是一个受病原物,包括稻瘟菌和白叶枯菌,诱导表达的基因,同时可以在植物激素诱导的条件下产生应答,研究它的启动子对阐明基因功能,探索抗病途径具有极大的意义。而水稻光合系统Ⅱ中一个编码10 kD多聚蛋白的基因,D54O,具有绿色组织特异性的表达模式,研究其启动子对分析组织特异性表达的调控机制,预测基因的功能有着重要作用,同时利用组织特异性的启动子可以帮助解决转基因安全性的问题。利用筛选到的包含OsWRKY13基因编码区的cDNA克隆,我们得到了包含完整基因信息的基因组亚克隆。经过预测,我们截取了728 bp的启动子片段,命名为PWRKY13。经转基因分析,该启动子可以被病原物和激素所诱导表达。在5’-末端的缺失试验、凝胶阻滞和定点突变的分析中,我们得到了一系列新的调控病原物诱导表达的顺式作用位点。对这些位点进行的酵母单杂交分析得到了与之结合的蛋白质信息,通过对编码这些蛋白质的基因的分析,我们发现这些蛋白都具有病原物诱导的表达模式,并且在细胞核中发挥其功能,有些还具有核定位信号或DNA结合功能,这说明这些蛋白具有核转录调控因子的特征。同时还筛选到一个在绿色组织中表达,在胚和胚乳中不表达的cDNA克隆,它编码一个光合系统Ⅱ中的10kD多聚蛋白。我们分离了该基因约2.1 kb的启动子区段,命名为PD54O。转基因植株证明该启动子特异性驱动外源基因在绿色组织中表达,而5’-末端的缺失导致了组织特异性表达谱的改变,同时伴随表达量的变化,说明了该启动子中含有调控组织特异性表达以及正或负调控基因表达量的顺式作用位点。通过凝胶阻滞的分析,我们确定了这些顺式作用位点,并采用定点突变的方法进行了验证。利用这些位点,通过酵母单杂交筛选到与之结合的转录调控蛋白,这些蛋白也被证明在不同组织中表达量存在很大差异,而且定位于细胞核中,推测这些蛋白可能具有转录调控的功能。研究得到的启动子资源可以有效地在植物的转基因育种中加以利用,更有效、更有针对性地表达外源基因,解决转基因育种中的安全性问题,是转基因育种的有力工具。而利用研究得到的顺式作用位点,我们在将来甚至可以按人们的要求,定制特异的启动子,为人们的生产谋利。
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