开花是高等植物生长发育过程中的重要环节,是植物由营养生长转向生殖生长的显著标志,更决定着植物的有性繁殖。花期及花期长短会直接影响植物的成熟、收获和产量。开花性状是遗传基础十分复杂的数量性状,受到植物内部多基因及外部环境因素(主要包括光周期和温度)等的综合调控。拟南芥中,众多与开花相关基因得到了深入分析,构建了调控开花的网络,特别是FT(Flowering locus T)特殊作用模式的发现,表明它就是科学家们一直寻找的“成花素”。油菜是我国重要的油料作物之一,农业生产上广泛种植的主要为甘蓝型油菜,属于芸薹科芸薹属,为包含两个基因组的异源四倍体,基因组结构复杂。根据开花是否需要低温春化,油菜主要分为冬性和春性两种类型。目前,芸薹属作物开花性状的研究,主要集中在QTL定位,·全基因组QTL的检测、互作分析和候选基因的预测等,缺乏对某些主效QTL的深入分析。本研究以Tapidor(欧洲冬油菜)与宁油7号(中国半冬性油菜)为亲本所构建的包含202株系的TNDH群体以及以宁油7号为轮回亲本、Tapidor为供体亲本所构建的近等基因系为材料,从两个层次对甘蓝型油菜开花性状进行了分析。首先是利用比较图谱和近等基因系对冬油菜环境下的主效QTL簇(qcFT.C6)进行深入解析,并对其进行了光周期敏感性的分析,进而在遗传学和基因组学水平上对甘蓝型油菜开花性状进行解析以及调控方面的探讨。在此基础上,以QTL簇区间内的“成花素”基因为研究对象,从甘蓝型油菜基因组中分离了6个FT基因拷贝,通过基因结构、序列同源性以及系统发生树等分析,初步揭示FT多拷贝序列间的规律以及可能的进化历程,并利用近等基因系初步证明2个拷贝的FT可能是QTL簇的关键基因,是QTL簇解析工作的很好延续。主要结果如下：1.利用与拟南芥基因组比对的信息,在QTL区间内定位了2个拷贝的FT和2个拷贝的AP1基因特异标记。在此基础上,重新整理了C6的遗传连锁图,明确了目标区段是由与拟南芥第一染色体的E区段(C1E)同源片段的反向重复组成,2个拷贝的FT就在反向重复的接合点附近；利用新的遗传图谱重新对花期进行QTL分析,发现QTL簇仍然只能在冬油菜环境下检测到,且2个FT基因标记位于QTL的峰值附近；由于标记的增加,不同环境下检测到的QTL出现移动现象：(1)大部分环境下检测的QTL位于从标记PA28到BRMS015区间,(2)其中5个环境的QTL出现在反向重复左边的区段,(3)1个环境的QTL出现在反向重复的右边区段。2.在BC4F2群体中,一些单株是先现蕾后抽苔,而另外一些单株却是先抽苔后现蕾,说明该QTL簇中存在独立控制着现蕾和抽苔性状的基因座位。利用不同近等基因系基因型和表型的差异分析,确定该QTL簇至少包含5个sub-QTL,分别命名为qcFT.C6-1, qcFT.C6-2, qcFT.C6-3, qcFT.C6-4和qcFT.C6-5。利用与拟南芥比较基因组分析推测5个sub-QTL可能的候选基因,如：qcFT.C6-3是FT, qcFT.C6-4是FKF1。由于近等基因系无论是在春油菜还是冬油菜环境下,开花时间都早于春性的轮回亲本宁油7号,且对Tapidor和宁油7号进行的光周期敏感性试验表明Tapidor的光周期敏感性远远强于宁油7号,因而进一步分析了QTL簇的近等基因系的光周期敏感性,结果表明16h长日照可以促进早开花,因此说明位于C6上的QTL簇是响应光周期的。3.在已报道的甘蓝型油菜群体花期QTL定位结果基础上,分析qcFT.C6在其他群体中的检测情况：(1)qcFT.C6只能在由冬、春性油菜亲本构建的群体中,且必须是在冬油菜环境下才能被检测到；(2)无论在冬油菜还是春油菜环境下,冬性和冬性或春性和春性油菜亲本杂交构建的群体都不能检测到qcFT.C6。进一步分析表明,QTL区间内的PCR标记在20份自然冬性甘蓝型油菜的品种中的分布呈现两种不同的状态：(1)Bog46-2, BnC6.FTa, BnC6.FTb, Na12A02和CCSSR1五个标记Tapidor的基因型比例很高,且这几个标记都分布在sub-QTL附近；(2)Na12A05, BnAP1a和028L01 AT3这三个标记Tapidor的基因型分布比例都很低,而这几个标记也都没有分布在sub-QTL附近。4.QTL初级定位分析发现,qcFT.C6这个QTL簇不能在春油菜环境下检测到；而位于A10连锁群的QTL只能在春油菜环境下被检测到,而且初步确定BnA10.FLC是该QTL的关键基因,因此我们推测春化途径或者BnA10.FLC可能调控着qcFT.C6的作用。利用qcFT.C6和BnA10.FLC的近等基因系杂交来初步探索互作关系,并将QTL簇的NIL和BnA10.FLC的NIL都与宁油7号回交作为对照,发现QTL簇的NIL与宁油7号回交的F1最早开花(播种后64和66天),BnA10.FLC的NIL与宁油7号回交的F1最晚开花(106天),而两种近等基因系杂交的F1(82和79天)与2类对照的开花时间差异都达到了极显著,说明BnA10.FLC可能部分抑制qcFT.C6的作用。5.无论是冬油菜环境还是春油菜环境,近等基因系的表型都早于春性的轮回亲本宁油7号,说明Tapidor中开花相关的等位基因功能强于宁油7号,也说明在宁油7号背景下这些基因不受抑制,可以同时持续作用。选取Westar, Monty, Andor, Bronowski和NRS-1五种春油菜与QTL簇的近等基因系杂交,结果显示：五种F1在武汉的花期都早于对照春油菜亲本,而且大约都早一个月到五十天左右,说明QTL簇区间Tapidor的等位基因其他在春油菜背景下同样不受抑制的促进开花。6.筛选Tapidor的BAC文库后,分离到了6个FT拷贝全长序列,并将其定位到TN遗传图谱上。A、C基因组各含3个拷贝,分别位于A2、A7、C2和C6四个连锁群,命名为：BnA2.FT, BnA7.FT.a、BnA 7.FT.b、BnC2.FT, BnC6.FT.a和BnC6.FT.b;与拟南芥电子比较作图显示,FT拷贝所在的区域都比对到拟南芥的1E区段,而且1E区段在A7和C6上以反向重复的形式存在；而FT就位于反向重复的接合点附近。7.甘蓝型油菜6个FT拷贝与拟南芥FT在CDS和氨基酸序列上分别呈现85-87%和80-85%的同源性,拷贝之间的CDS和氨基酸序列上的同源性分别呈现92-99%和89-99%。且这些拷贝间的同源性呈现一定的规律,以CDS序列为例：1)A、C基因组同源区段对应的拷贝,如BnA2.FT和BnC2.FT等,呈现最高的99%同源性；2)反向重复区段中包含的对应拷贝,如BnC6.FT.a和BnC6.FT.b等,呈现较高的97%同源性；3)除了以上两种情况的其他拷贝间,如BnA2.FT和BnC6.FT.a等,呈现相对低的92%同源性。8.进化树分析表明：芸薹属与拟南芥有着共同的祖先FT基因。：芸薹属FT基因在进化过程中首先分化出2个同源世系Bx.FT-1和Bx.FT-2,随后Bx.FT-2所在的染色体区域发生重复,形成非常同源的2个FT拷贝Bx.FT-2a和Bx.FT-2b,完成了三倍化的过程。随着A、C基因组的分化,上述FT的三个拷贝又分别形成了现存的Bn.A2.FT、BnC2.FT以及BnA7.FT.a和BnC6.FT.a以及BnA7.FT.b和BnC6.FT.b。序列分析表明,由Bx.FT-2进化来FT基因的intron1中检测到了CArG-box,而由Bx.FT-1进化来的FT基因的intron1中则没有检测到相应结构的存在。9.将拟南芥FT作为进化分析的参照,利Ks值来估算进化事件发生的时间。芸薹属与拟南芥FT的Ks值是0.33-0.36,即拟南芥与芸薹属分化时间在大约在12-13百万年前。Bx.FT-1和Bx.FT-2以及Bx.FT-2a和Bx.FT-2b的Ks值分别是0.17-0.19和0.071-0.072,说明芸薹属古生种第一次和第二次的复制事件发生在大约6-7和2.5百万年前。A、C基因组的分化是在第二次复制事件以后,大约在1.5-2百万年前,而由白菜和甘蓝天然杂交形成甘蓝型油菜的时间大约是0.12-0.21百万年前。利用Ks值估算进化事件的发生的顺序与由FT构建的系统发生树分组的结果是吻合一致的。10.6个FT拷贝中,3个定位在TN图谱的A2和C6花期QTL的置信区间内。因近等基因系与轮回亲本宁油7号以及两个近等基因系之间的花期都存在显著差异,推测位于qcFT.C6区间内的2个FT拷贝在双亲中存在功能差异,可能是QTL簇的关键基因。为了进一步验证这3个FT拷贝的候选基因对甘蓝型油菜开花的影响,将3个FT拷贝在55份自然甘蓝型油菜品种中进行关联分析,发现3个FT拷贝的宁油7号和Tapidor的等位基因分别普遍出现在春油菜和冬油菜品种中。11.将TN图谱上有序列信息的标记比对到拟南芥记的基因位点,并利用拟南芥基因位点为中介检测甘蓝型油菜基因组中存在的反向重复区段。除了A7和C6连锁群的2个反向重复区段,我们还发现了其他8个反向重复区段的存在,这10个反向重复区段分布在8个染色体上,而且覆盖了能和拟南芥比对上的基因组的四分之一。由于很多有信息的标记是从白菜测序BAC开发的,所以检测到的大部分反向重复区段都在A基因组出现,而对应C基因组的并没有检测到。BAC-FISH实验表明E区段在基因组中确实以反向重复形式存在。