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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌(Escherichia coli)和无乳链球菌（Streptococus agalactiae）是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。本研究应用SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR技术建立针对以上细菌的单重和多重快速诊断方法。 单重诊断方法:根据金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌rrnB基因和无乳链球菌tuf基因的核酸序列设计特异引物。扩增产物经克隆测序后，将阳性重组质粒进行浓度梯度稀释，以稀释得到的重组质粒作为模板标准品建立3种病原菌的检测标准曲线:金黄色葡萄球菌y=-3.415x+14.02，R2=0.996;大肠杆菌y=-3.498x+9.2777，R2=0.999;无乳链球菌y=-3.298x+10.37，R2=0.998。扩增效率分别为:96.3％，93.1％和101.0％。该方法可检测的最低浓度分别为6.08×103copies/μl、7.18×103copies/μl和5.30×103copies/μl。经融解曲线分析，特异性良好，无非特异性扩增。重复性试验表明，金黄色葡萄球菌3个浓度标准品的批内变异系数分别为1.56％、0.79％和1.77％，批间变异系数分别为1.53％、2.26％和2.57％;大肠杆菌批内的分别为1.56％、1.52％和2.46％，批间的分别为3.04％、1.45％和3.75％，无乳链球菌批内的分别为2.74％、1.89％和0.98％，批间的分别为3.02％、1.97％和1.93％。以上结果表明，3种致病菌单重SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。 多重诊断方法:在上述单重荧光定量PCR的基础上，利用三种病菌扩增产物不同的TM值，进行多重定性分析。融解曲线结果表明，金黄色葡萄球菌TM值为79.3-80.3、大肠杆菌为85.1-86.1、无乳链球菌为81.6-82.6;可以同时检测3种病原菌。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌有特异性的峰值出现，无非特异性扩增。三种病原菌多重检测的最低浓度低于单重检测结果。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的TM值重复试验的批内变异系数分别为:0.1％、0.09％和0.08％，批间变异系数分别为:0.30％、0.44％和0.43％。结果表明，3种致病菌的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定性PCR方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。 结论:本研究成功建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌单菌的SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法及多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定性PCR方法，可以对这3种病原菌进行定量或定性的快速检测。