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重楼种属关系复杂,分类系统混乱,种间形态差异和遗传变异较大,且不同种的重楼之间活性成分含量差异大,而重楼的种子繁育也一直未取得令人满意的结果。本课题在对种植基地内的重楼进行分类鉴定(以《中国植物志》为准)的基础上,通过HPLC分析不同种重楼的活性成分含量(重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元),运用RAPD分子标记技术分析重楼的遗传多样性,采用摸索出的一种全新的种子快繁体系进行重楼种苗的繁育,最终取得了以下科研成果: 1.参考李恒的重楼分类系统,以《中国植物志》为准,对种植于稀有中药材繁育基地内的重楼进行分类鉴定,以确定栽培重楼的种属关系。经中南民族大学药学院万定荣教授和生命科学学院刘虹副教授鉴定为9个种,确定其中4种:七叶一枝花、华重楼、狭叶重楼和球药隔重楼,另外5种为疑难种。 2.五种甾体皂苷的分布情况差别很大。重楼皂苷Ⅶ和Ⅰ在9种重楼中均有分布,重楼皂苷Ⅵ在其中6种重楼中有分布,而重楼皂苷Ⅱ和薯蓣皂苷分别只在其中4种和3种重楼中有分布。因此,重楼皂苷Ⅶ和Ⅰ在9种重楼中分布最广,其次为重楼皂苷Ⅵ。五种甾体皂苷的含量在9种重楼中存在极大差异。重楼皂苷Ⅶ和Ⅵ含量最高的是球药隔重楼;重楼皂苷Ⅱ和Ⅰ含量最高的是七叶一枝花;薯蓣皂苷含量最高的是七叶一枝花和球药隔重楼;5种甾体皂苷总含量的高低顺序依次是:球药隔重楼≈七叶一枝花﹥种3﹥华重楼﹥种1﹥种9≈狭叶重楼≈种10﹥种2。 3.薯蓣皂苷元在9种重楼的根茎中均有分布,但含量差异极大。薯蓣皂苷元含量的高低顺序依次是:七叶一枝花>种2>华重楼≈种3>球药隔重楼>种9>种1>狭叶重楼≈种10。9种重楼中甾体皂苷总含量和薯蓣皂苷元的含量之间具有较大的相关性。除种2外,甾体皂苷总含量较高的4种重楼(七叶一枝花、球药隔重楼、种3和华重楼)均具有较高含量的薯蓣皂苷元,而其它4种甾体皂苷总含量较低的重楼(种1、种9、狭叶重楼和种10)则具有较低含量的薯蓣皂苷元。 4.从269条RAPD随机引物中筛选出了22条扩增稳定且条带清晰的引物,对电泳谱图上清晰稳定的条带进行统计,共检测到87个清晰的扩增位点,条带大小在300bp~2600 bp之间,其中多态性位点79个,多态位点百分比达90.80%,表明9种重楼在物种水平上具有丰富的多态性。而UPGMA聚类分析的结果表明,9种重楼的相似度系数在0.4368~0.9310之间,表明重楼属植物在种间存在较大的遗传变异。9种重楼被聚为两个大类,其中种1、种2、种3和种9为第一大类,种10、七叶一枝花、华重楼、狭叶重楼和球药隔重楼为第二大类,这与《中国植物志》将华重楼和狭叶重楼划为七叶一枝花的变种的分类结果相一致。 5.将种子快速萌发技术与器官培养相结合进行重楼种苗的繁育,最终确定了种子最佳预处理方式、组织培养阶段合适的种子胚根长度、组织培养的培养方式、培养基的最适激素配比、是否添加GA3等培养条件,并摸索出一种全新的快繁体系,成功繁育出了无菌苗。该快繁体系大大缩短了育苗周期,只需5~6个月便可获得大量种苗,而且出苗率高达73.32%。