研究背景:由于环境,饮食,生活习惯与工作压力,以及遗传等因素,肿瘤的发生率与死亡率一直居高不下,其中一个导致死亡的重要原因是肿瘤的转移。但迄今对于肿瘤转移的分子机制仍然不太清楚。近几年来,越来越多的证据显示血小板在肿瘤的转移中起着重要的作用。血小板在肿瘤转移中的机制可能有以下几种:1.人们发现很多肿瘤细胞直接诱导血小板活化(释之为:Tumor cell-induced platelet aggregation TIPA)。活化的血小板释放很多细胞因子,包括血小板衍生血管生长因子等。这些细胞因子能够促进肿瘤细胞的转移和生长,有助于血管的再生;2.肿瘤细胞导致血小板活化,活化的血小板通过释放ADP合成血栓烷A2(TXA2)等,最后导致整合素糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的活化。肿瘤患者活化性的血小板升高,更加促进了上述过程的发生发展;3.活化的血小板直接粘附在肿瘤细胞表面,从而帮助肿瘤细胞逃避机体的免疫攻击,同时也有助于肿瘤细胞的着床、粘附,从而有利于肿瘤细胞的转移。在血小板与肿瘤细胞的相互作用中,PDPN是关键因素之一。PDPN是Ι型唾液粘蛋白,是淋巴管内皮的特异性标志物。PDPN胞外区中的EDxxVTPG片段是刺激血小板聚集的结构域(platelet–aggregation-stimulating,PLAG),其中Thr52是O-聚糖唾液酸化的位点,血小板表面表达的CLEC-2是PDPN的内源性受体,与PDPN结合依赖于O-聚糖唾液酸的存在中心,不依赖血浆成分,结合后可以直接诱导血小板的活化聚集。最近发现很多肿瘤细胞(肺肿瘤、胃肿瘤、肠肿瘤、鳞状上皮细胞癌、恶性间皮瘤、Kaposi肉瘤、血管肉瘤、睾丸精原细胞瘤和脑肿瘤等)表达PDPN上调,PDPN上调能引起血小板活化,这可能是血小板促进肿瘤转移与生长的基础。抗PDPN的PLAG区功能性单克隆抗体通过抑制PDPN与CLEC-2的结合,阻止血小板的活化聚集,从而能抑制肿瘤的转移,而且不会出现抗血小板聚集药物引起的出血风险,有很大的临床应用价值。抗人PDPN抗原不同表位的单克隆抗体可以建立起双抗体夹心elisa法,用于检测癌症等患者的血浆中可溶性pdpn(spdpn)的水平。血浆中spdpn的水平在肿瘤的诊断与预后中的作用有待确定。目的:本研究旨在应用单克隆抗体技术,制备能够识别pdpn蛋白的单克隆抗体,用以探讨pdpn与肿瘤转移的关系;建立双抗体夹心方法,检测癌症患者血浆中spdpn的含量,研究spdpn在肿瘤的发生发展中的作用。方法:(1)首先免疫balb/c小鼠,22肽的多肽片段(dtettgleggvampgaeddvvc)与钥孔戚血蓝素(klh)偶联作为免疫原。dtettgleggvampgaeddvv是位于pdpn蛋白结构功能区域的第31-51位氨基酸。(2)经过传统单克隆抗体制备技术,制备出抗pdpn的单克隆抗体;然后以商品化抗pdpn单抗18h5为阳性对照,以正常小鼠igg为阴性对照,用酶联免疫吸附试验(elisa)、蛋白印迹(westernblot)和流式细胞(flowcytometry)方法验证单克隆抗体与pdpn的特异性结合能力。(3)抗pdpn抗体体外功能的研究:pdpn能够与血小板表面表达的clec-2结合,并且活化血小板,诱导血小板聚集。肿瘤细胞表面表达pdpn上调,将抗pdpn抗体与肿瘤细胞提前混合反应,然后再与血小板(prp)混合,用血小板聚集仪检测血小板聚集情况。从而分析抗pdpn抗体能否抑制pdpn诱导的血小板聚集。(4)抗pdpn单克隆抗体在检测人血浆中spdpn含量的应用:两种单克隆抗体sz-168和sz-163可以与pdpn的不同抗原表位结合,以此建立双抗体夹心elisa方法,用该法检测癌症等患者的血浆spdpn水平,从而分析血浆spdpn水平在肿瘤的发生发展及诊断中的作用。结果:用偶联了klh的22个氨基酸组成的pdpn多肽免疫balb/c小鼠,经过三次免疫程序,最后小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体。经间接elisa法成功筛选出两株单克隆抗体sz163和sz168,经腹水扩大生产后,纯化,测得效价分别为500ng/ml和15ng/ml,然后用elisa、westernblot和flowcytometry(fcm)方法验证单克隆抗体与还原性pdpn以及天然的细胞表面表达的pdpn结合的特异性。结果显示该抗体具有免疫结合的特异性。另外,我们通过FCM方法,应用单抗SZ168检测到NCI-H226细胞表面高水平表达PDPN蛋白。通过血小板聚集仪,利用NCI-H226细胞检测到单抗SZ168能够抑制PDPN诱导的血小板聚集(10μg/ml:抑制率-74.6%、6μg/ml:抑制率-66.1%、3μg/ml:抑制率-8.47%)。最后,我们建立了双抗体夹心ELISA方法(SZ163包板,辣根过氧化物酶标记的SZ168作为酶标单抗),检测了肿瘤患者(胃癌、肺癌、肠癌)与正常志愿者血浆中的sPDPN的含量,统计分析显示,肿瘤患者血浆中sPDPN含量高于正常志愿者血浆中的含量(P<0.01),肿瘤患者中发生转移的血浆中sPDPN含量高于未发生转移的血浆中sPDPN含量(P<0.01)。结论:(1)利用杂交瘤技术成功制备了两株效价高、特异性好的抗PDPN单克隆抗体SZ163与SZ168。这两株抗体具有抗原识别特异性,能用ELISA、FCM和Western Blot鉴定,并且可以应用FCM来检测细胞株上PDPN的表达量。(2)体外实验证明,高表达PDPN的肿瘤细胞能够诱导血小板聚集,抗PDPN的单克隆抗体SZ168与肿瘤细胞混合后再与血小板反应,能够抑制血小板的聚集。这为进一步研究PDPN在肿瘤转移中的作用提供支持依据。(3)双抗体夹心ELISA法检测正常志愿者与肿瘤患者血浆中sPDPN的含量,结果说明sPDPN能够作为肿瘤标志物,且能够提示肿瘤的发生与转移情况。