蛋白质组学是一门以蛋白质组为对象,研究其组成、功能及其蛋白之间的相互作用的科学,是后基因组时代的研究热点之一。随着质谱技术的迅猛发展,蛋白质组学研究也取得了长足进步,前景广阔。蛋白质组学的研究策略主要分为自上而下、自中而下以及自下而上三种策略,其中自下而上策略的工作流程是将提取的蛋白质样品进行消化,产生适宜长度的肽段,再经质谱检测以及数据库匹配分析,最终完成对目标蛋白质的鉴定。该策略所产生的特异性消化肽段适于质谱检测,且获取的研究信息更为丰富,已成为蛋白质组学研究的主要技术。其中,蛋白质样品的酶解效果对于质谱检测的结果影响巨大,蛋白样品的酶解程度决定了肽段的产出效率和质谱谱图质量;可以降低样品复杂度,提高质谱鉴定效率;提高定量精度。所以蛋白质组学研究中常用位点特异性高活性工具酶的研发尤为重要。特异性切割赖氨酸和精氨酸的羧基端肽键的胰蛋白酶(Trypsin)是蛋白质组学研究最常用的工具酶,但随着蛋白质组学研究的深入和不同氨基酸序列蛋白质组样品鉴定要求的提升,赖氨酰基内切酶(Lys-C)、天冬氨酸酰胺基内切酶(Asp-N)和谷氨酰内切酶C(Glu C)等越来越多的蛋白酶得到了开发和应用。其中,Glu C特异地切割蛋白质的谷氨酸或者天冬氨酸残基羧基端的肽键,不仅有利于鉴定碱性氨基酸缺乏的蛋白质,提高对磷酸化肽段的鉴定效率;与其他蛋白酶联用,还可显著提高蛋白质鉴定的序列覆盖度,提升质谱检测的可信度。但目前商品化的Glu C主要依赖从金黄色葡萄球菌或蛋白酶缺陷型枯草杆菌中提取制备,产率低,价格昂贵,在一定程度上限制了该酶的使用。目前已有学者开展了Glu C在大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、变铅青链霉菌等微生物重组表达系统中的高效表达及纯化研究。但该酶自身易形成包涵体,也易被降解,产率低,难于工业化。我们选用大肠杆菌作为表达系统,将金黄色葡萄球菌Glu C成熟蛋白编码基因读码框序列经密码子优化后连接到p GEX-4T-2表达载体形成p GEX-4T-2-Glu C原核表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)得到基因工程菌株;通过对重组蛋白质诱导表达条件的摸索,实现了重组蛋白质在大肠杆菌的可溶性高表达。根据预测的重组蛋白质的特性,组合使用GST标签亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析实现了Glu C的纯化和高纯度制备。将制备的Glu C和商品化Glu C同时酶切标准牛血清白蛋白(BSA)和酵母全细胞蛋白质裂解物,并利用非标定量蛋白质组学技术系统比较了二种酶在酶切效率、酶切特异性、蛋白质覆盖度及鉴定量等方面的差异,证明我们制备的Glu C具有很好的生物活性,为该酶在我国蛋白质组学研究中的广泛应用创造了条件。